Введение к работе
Актуальность проблемы. Важнейшие процессы, происходящие в различных
биологических системах (клеточная дифференшровка и морфогенез в ходе эмбрионального развития и регенерации, программируемая гибель клеток или их опухолевое перерождение и т.д.) находятся под контролем специфических регуляторных генов. Для понимания молекулярных механизмов, лежащих в основе биологических процессов, необходимо выявление и изучение генов, вовлеченных в регуляцию этих процессов. В настоящее время большинство методов молекулярной биологии, направленных на решение этих задач, основаны на использовании полимеразной цепной реакции, сделавшей доступным работу с малыми количествами биологического материала Однако для применения ПЦР необходимо знание нуклеотидной последовательности амшшфицируемой ДНК. И если методики амплификации известных последовательностей разработаны очень хорошо, то применение ГЩР в случаях, когда нуклеотидная последовательность частично или полностью неизвестна, наталкивается на серьезные проблемы, особенно в вопросах искусственного присоединения к ДНК олигонуклеотидных последовательностей, могущих служить местом посадки праймера в ПЦР, а так же во избежание "фоновой" амплификации (во многих случаях количество "балластной" ДНК на несколько порядков превышает количество "целевой" ДНК).
Несмотря на значительный прогресс в развитии методов, использующих ГЩР, наличие множества технологических трудностей в работе со сложными популяциями фрагментов ДНК (геномной ДНК или суммарной кДНК) не позволяет считать разработку этого раздела генной инженерии близкой к завершению. Таким образом, создание новых высокоэффективных методов анализа геномов и продуктов их экспрессии является актуальной проблемой современной молекулярной биологии.
Цель работы. Целью данной работы являлось создание высокоэффективных методов работы со сложными образцами ДНК, позволяющими выявлять и исследовать новые, функционально важные гены. В ходе исследования решались следующие задачи: изучение эффекта селективной супрессии ПЦР (ССГГ) и оптимизация параметров, влияющих на эффективность ССП, разработка ряда новых методов основанных на
эффекте ССП, таких как метод создания библиотек кДНК из малых количеств клеток, методы выявления дифференциально экспрессирующихся генов путем прямого сравнения сложных популяций мРНК, методы получения полноразмерных копий кДНК и выявления регуляторных областей генов, метод создания нормализованных библиотек кДНК, метод клонирования ДНК in vitro и некоторых других.
Предложенные методы были использованы для исследования молекулярно-генетических основ ряда важных биологических процессов, включая тканеспецифнческую экспрессию генов, изменение метастатического потенциала опухолевых клеток, изменение экспрессии генов в ходе репаративной регенерации у планарий и регенерации хрусталика глаза у тритонов, раннего эмбрионального развития нервной системы у позвоночных животных н некоторые другие.
Научная новизна и практическая ценность работы. Описанный в настоящей работе эффект селективной супрессии ПЦР позволил разработать ряд высокоэффективных взаимодополняющих методов выявления и анализа новых функционально важных последовательностей ДНК и РНК при полном или частичном отсутствии информации об их первичной структуре. ССП-эффект практически полностью ингибирует амплификацию нежелательной фракции ДНК, сохраняя экспоненциальный характер амплификации целевых последовательностей. Это позволяет отказаться от трудоемких и низкоэффективных методов физической сепарации различных фракций ДНК и делает разработанные на основе ССП методы более удобными, быстрыми и воспроизводимыми.
Описанные в данной работе методы в настоящее время используются для решения широкого круга задач молекулярной биологии по изучению геномов и продуктов их экспрессии. Например, использование предложенных методов позволило нам выявить и клонировать полноразмерные кДНК копии ряда функционально важных генетических последовательностей, вовлеченных в регуляцию регенерации у планарий. Анализ экспрессии выявленных генов позволил впервые продемонстрировать индукционные взаимодействия в теле планарий при регенерации. Предложенные в настоящей работе методы поиска дифференциально экспрессирующихся генов могут применяться для выявления генов, зменения в экспрессии которых связаны с развитием различных
заболеваний. Полученная информация о структуре таких генов может быть использована для создания лекарственных препаратов, обладающих высокой специфичностью действия.
Выявление новых флуоресцентных белков с помощью описанных в работе методов открывает новые перспективы развития систем анализа экспрессии генов in vivo, что имеет важное практическое значение для биотехнологии и медицины.
Апробация полученных результатов. Результаты диссертационной работы были представлены на следующих симпозиумах и конференциях: VIII Международном симпозиуме по клеточной дифференцировке (Хиросима, 1994), Русско-немецком симпозиуме по молекулярной и медицинской генетике (Кельн, 1995), Международном форуме по регенерации (Миннеаполь, 1995), Конгрессе Европейского общества по биологии развития (Тулуза, 1995), V Всеросийской конференции "Генная и клеточная инженерия" (Москва, 1995), 24-том Съезде Европейского биохимического общества (Барселона, 1996), Международной конференции по регенерации (Кельн, 1997).
Циклы работ по созданию методов поиска и анализа дифференциально экспрессирующихся генов и по исследованию регенерации хрусталика глаза у тритона, в которых были представлены отдельные этапы этого исследования, получили премии МАИК "Наука" за 1996 год, а так же журнала Биоорганическая химия за 1996 и 1998 годы.
Публикации.
Диссертация обобщает данные 40 основных публикаций.
Личный вклад автора. Автору принадлежит ведущая роль в выборе направлений исследований, разработке и экспериментальной проверке всех предложенных в настоящей работе методов, обсуждении и оформлении полученных результатов в совместных исследованиях с сотрудниками ИБХ РАН, ИБР РАН, ИЭМЖ РАН, института Биохимии РАН, Кардиологического Центра, Центра развития биотехнологии Бостонского университета (США) и Clontech Laboratories Inc. (США).