Введение к работе
Актуальность проблемы.
Одним из важнейших направлений молекулярной и клеточной биологии является изучение механизмов канцерогенеза и поиск новых путей терапии опухолей. Идентификация перспективных молекулярных мишеней имеет большое значение для разработки новых, более эффективных методов терапии рака. Исследования последних лет показали, что киназа р38 (представитель семейства митоген-активируемых протеин-киназ - МАПК), принимает участие в важнейших клеточных процессах - пролиферации, апоптозе, старении и дифференцировке, нарушение которых является причиной опухолевой трансформации. Имеются многочисленные данные, полученные в экспериментах in vitro, указывающие на антипролиферативную и проапоптотическую роль р38 киназы (Bulavin et al. 1999; Casanovas et al. 2000), а также некоторые свидетельства ее опухолесупрессорнои активности in vivo (Bulavin etal. 2002).
Киназы p38 относятся к групппе стресс-активируемых протеинкиназ, которые активируются в ответ на разнообразные стрессовые воздействия - ультрафиолетовое облучение и у-радиация, действие различных химических агентов, осмотический шок, тепловое и механическое воздействие. К активации МАПК р38 приводят также удаление ростовых факторов, воздействие воспалительных цитокинов и некоторых митогенов, повышение экспрессии ряда онкогенов. В клетках млекопитающих идентифицировано четыре изоформы р38 киназы - p38a/CSBP/SAPK2a, p38p/SAPK2b, p38y/SAPK3/ERK6 и p388/SAPK4, две из которых - р38а и р38р, экспрессируются во всех тканях. Принимая во внимание также тот факт, что полная инактивация р38а летальна, можно предположить, что именно эта изоформа наиболее важна для всего организма.
Субстратами для р38а являются важнейшие белки, участвующие в регуляции клеточного цикла и апоптоза. Так, р38а может фосфорилировать и стабилизировать один из основных опухолевых супрессоров - белок р53 (Bulavin et al. 1999), а также одну из его мишеней - ингибитор циклин-зависимых киназ p21Wan (Kim etal. 2002). В то же время р38а негативно регулирует некоторые активаторы клеточного цикла - циклин D1 (Lavoie et а!. 1996; Casanovas et al. 2000), активаторные фосфатазы циклин-зависимых киназ Cdc25A (Goloudina et al. 2003), Cdc25B и Cdc25C (Bulavin & Fornace 2004).
Для активации p38 in vivo важнейшее значение имеют вышестоящие киназы МАПК каскада - МККЗ и МККб (Brancho et al. 2003). Они фосфорилируют остатки треонина и тирозина в последовательности Thr-X-Tyr, присутствующей в активаторной петле киназного домена р38, что приводит к ее активации. Негативная регуляция р38 киназ на посттрансляционном уровне осуществляется протеин-фосфатазами, дефосфорилирующими треониновый или тирозиновый активаторные аминокислотные остатки, или оба из них. В
2 инактивации р38 принимают участие фосфатаза РР2Са, фосфатазы семейства DPS (МКР) и недавно описанная фосфатаза Wip1. Последняя представляет наибольший интерес, поскольку ее экспрессия носит р53-зависимый характер и может, таким образом, осуществлять обратную связь в регуляции стабильности р53 (Takekawa et al. 2000). Роль этой фосфатазы в инактивации р38 киназы in vivo и в туморогенезе недостаточно изучена. Известно, что ген PPM1D, кодирующий фосфатазу Wip1, амплифицирован в некоторых опухолях человека, что приводит к нарушению опухоль-супрессирующей функции р53 (Bulavin et al. 2002). Идентификация гена PPM1D у мыши и получение мышей с нокаутом по этому гену сделало возможным изучение роли фосфатазы Wip1 и киназы р38а (далее р38) в туморогенезе in vivo.
Цели и задачи исследования.
Цель настоящей работы заключалась в изучении роли фосфатазы Wip1 и киназы р38 в регуляции клеточной пролиферации и канцерогенезе. В связи с этим задачи исследования были сформулированы следующим образом:
Разработать и охарактеризовать клеточную модель для изучения роли киназы р38 в супрессии канцерогенеза.
Получить мышей с инактивацией киназы р38 и провести анализ их чувствительности к развитию некоторых опухолей, в частности, полипозу кишечника.
Получить мышей с предрасположенностью к полипозу кишечника и одновременной инактивацией Wip1 для изучения влияния активации р38 каскада на развитие этой формы опухолей.
Основные положения, выносимые на защиту.
Конститутивная активность р38 каскада, вызванная инактивацией фосфатазы Wip1 или активацией киназы МКК6, приводит к значительному снижению способности трансформированных клеток образовывать опухоли.
Способность фибробластов Wip1', трансформированных различными онкогенами, к образованию опухолей снижается за счет повышения уровня p16INK4 -ингибитора активности циклин-киназных комплексов, и белка p19ARF.
Подавление туморогенеза при инактивации фосфатазы Wip1 не зависит от опухолевого супрессора р53.
Мыши с нокаутом гена PPM1D устойчивы к аденоматозному полипозу кишечника, вызванного мутацией в гене АРС (АРС'"п).
Научная новизна.
Впервые установлено, что инактивация фосфатазы Wip1 в трансформированных эмбриональных фибробластах мыши снижает способность клеток образовывать опухоли при пересадке бестимусным мышам.
Показано, что наблюдаемое подавление туморогенеза обусловлено повышением уровня ингибитора активности циклин-киназных комплексов p16INK4 и белка p19ARF, причем действие последнего не опосредовано через р53, что говорит о существовании дополнительных опухоль-супрессорных функций у p19ARF.
Обнаружено, что активация р38 каскада в клетках HeLa с индуцибельной экспрессией киназы МКК6 незначительно влияет на пролиферацию клеток in vitro, но достаточна для опухолевой супрессии in vivo.
Впервые показано, что инактивация 'фосфатазы Wip1 вызывает устойчивость к полипозу кишечника у мышей с мутацией АРСҐ".
Теоретическое и практическое значение работы.
Полученные данные свидетельствуют о важной роли киназы р38 в супрессии опухолегенеза in vivo. Один из механизмов этого эффекта - повышение уровня белков p16INK4 и pi9ARF за счет усиления их транскрипции. Эти факты расширяют существующие представления о функциях р38 и говорят о необходимости поиска новых мишеней р38 и регуляторных путей, в которые может быть вовлечена эта киназа. Зависимость супрессорной способности р38 от p19ARF в отсутствие р53 подразумевает существование у белка p19ARF дополнительных функций, не зависимых от р53. Важное практическое значение имеет выявленный в работе противоопухолевый эффект инактивации фосфатазы Wip1, которая может оказаться перспективной мишенью при терапии рака.
Отсутствие выраженного влияния активации р38 на пролиферацию и апоптоз in vitro при сильном опухоль-супрессорном действии in vivo показывает, что для скринирования противораковых средств требуется использование методов in vivo или разработка новых тестов для клеточных культур. Широко используемые сейчас методы оценивают, в основном, уровень пролиферации и апоптоза, отсеивая, таким образом, потенциально перспективные соединения, не влияющие на эти параметры.
Апробация работы.
По теме диссертации опубликовано три печатные работы. Основные положения доложены и обсуждены на научных семинарах лаборатории Молекулярных основ дифференцировки клетки Института цитологии РАН, лаборатории Базовых исследований Национального института рака при Национальных институтах здоровья (США, Бетезда) и лаборатории Контроля клеточного цикла и туморогенеза Института молекулярной и клеточной биологии (Сингапур).
Объем и структура диссертации.
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов, обсуждения результатов и списка цитируемой литературы,
4 содержащего 2сЬ публикаций. Работа изложена на &?д страницах машинописного текста и иллюстрирована 22- рисунками.
