Введение к работе
Актуальность проблемы.
Данная ' работа посвяшена одной из наиболее важных и актуальных проблем современной молекулярной биология - регуляции транскрипционной активности генов. Изменение транскрипционной активности генов является существенным моментом в регуляции многих биологических процессов, включая контроль роста клеток, их дифферекцировку и злокачественное перерождение. Передача внеклеточных сигналов, в том числе от факторов роста, влияющих на экспрессию генов, осуществляется с помощью цитоплазматических сигнальных путей, необходимыми компонентами которых являются протеинкиназы. Одним из механизмов взаимодействия между цитоплазмой и ядром является фосфорилирование и/или дефосфорилирование транскрипционных факторов.
Под контролем фосфорилируемых транскрипционных факторов находятся различные гены, в том числе гены, регулирующие пролиферацию клеток. Контроль клеточной пролиферации представляет собой сложную систему, в которую включено множество взаимодействующих между собой факторов. Нарушение контроля пролиферации является ключевой стадией онкогенеза. В этом процессе важную роль играет семейство генов шус(с-вус, N-myc, L-шус). Наиболее изученный член этого семейства - ген с-шус, экспрессия которого характерна как для трансформированных, так и для нетрансформированных клеток. Этот ген имеет сложную систему позитивной и негативной регуляции, и его экспрессия строго коррелирует с клеточной пролиферацией. Учитывая сказанное выше, мы предположили, что этот ген может регулироваться через фосфорилирование клеточных транскрипционных факторов и осуществили экспериментальный поиск таких факторов.
Цель и задачи работы.
Целью настоящей работы было исследование роли фосфорилированных ДНК-связываюших белков в регуляции транскрипции гена с-гаус.
Экспериментальные задачи исследования заключались в . следующем:
1. Получить препараты гиперфосфорилированных клеточных
белков in vitro, а также клетки в культуре, содержащей гиперфосфорилированные белки.
-
Определить влияние ортованадата на дефосфорилирование аминокислотных остатков (т.е. определить, на какие фосфатази действует ортованадат).
-
Выяснить влияние ингибирования дефосфорилирования на скорость роста клеток.
-
Выявить влияние ингибирования дефосфорилирования, вызванного ортованадата на транскрипцию гена с-шус і л vivo и in vitro.
-
Идентифицировать фосфобелки, принимающие участие в регуляции транскрипции гена с-шус.
-
Определить специфические участки связывания возможных ДНК-связывающих белков в промоторной области гена с-тус.
Для выяснения влияния фосфорилирования на активность факторов транскрипции используют активаторы протеинкиназ или ингибиторы фосфатаз. Один из таких ингибиторов фосфатаз "-' ортованадат натрия (NaVO ), который является структурным аналогом фосфата. Он связывается с фосфат-узнающим центром фосфатаз, в том числе протеинфосфатаз; это связывание определяет ингибирующее действие ортованадата иа протеинфосфатазы.
Научная новизна и практическое значение работы.
В лизате клеток HeLa обнаружены ранее яе идентифицированные фосфобелки при, инкубации клеток с ортованадатом, натрия. Полный гидролиз белков показал, что молярное соотношение остатков Р-Tyr/P-Ser/P-Thr в клетках, не подвергавшихся действию ортованадата, составляет 1/30/20. После инкубации с 0,1 мМ ортованадата это соотношение сохраняется, однако наблюдается увеличение количества фосфорилированных остатков Туг, Ser и Thr в 2 раза. Следовательно, происходит подавление дефосфорилирования как фосфотирозяновых, так и фосфосериновых и фосфотреониновых остатков. Установлено, что добавление ортованадата и фосфорилирование клеточных белков приводит к усилению транскрипции гена с-иус in vitro со стартов Р1, Р1а и Р2. Выявлены ДНК-связывающие белки с молекулярными массами 23, 35 и 70 кДа, связывающиеся с промоторной областью гена с-тус только в
фосфорилированной форме. Определены участки связывания указанных белков.
Полученные результаты дополняют известную схему регуляции
транскрипции гена с-тус, в частности, вовлекая
фосфорилирование/дефосфорилирование в активацию ДНК-связывающих белков, что весьма важно для понимания природы канцерогенеза и поиска путей возврашения клетки в нормальное пролиферативное - состояние.
Апробация работы.
Основные научные результаты работы представлены на X Российско-Германском симпозиуме "Структура и функция генома" (Суздаль, 1993), на Всероссийской конференции "Геном человека" (Черноголовка, 1993), на конференции "Приоритетные направления генетики" (Москва, 1993), на Международном симпозиуме "Современные тенденции в вирусологии и иммунологии опухолей", > посвященном 100-летию со дня рождения Л.А. Зильбера (Москва, 1994).
Об'єм и структура диссертации.
Диссертация состоит из введения, трех глав (обзор литературы, материалы и методы, результаты и обсуждения), выводов и списка цитированной литературы, состоящего из 129 наименований. Работа и-зложека на >%г страницах машинописного текста, содержит рисунков и S таблиц.