Введение к работе
Актуальность работы. согласно теории ы. козак, описывавшей иеханизн иншшашга трансляции у зукэриот (так называемой "сканирующей иолели"), узнавания эукариотическиии рибосомами ияішиаторннх AUG колонов больпннства иРНК обязательно предшествует стадия их связывания с 5'-кониевыыи кеп-структураии натрии с последующим сканированием нуклеотшшых последовательностей 5'-нетранслируе«ых районов (НТР! uphk. которое сопровождается плавлениеы их вторичноя структури.
Известно, что инициация трансляции РНК вируса зниевалоииокардита (БЗЫЮ такие, как и лругих пикорнавиР7сов, происходит по несбычноау механизму, состояшецу в связывании 40S субчастнп зукариотических рабосои пгяио с внутренними участками 5'-нетраислируеиого района (НТР) вирусной .рнк. Инипиания такого типа пслэтила название внутрєнйєп инициации трансляции. Показано, что необнчнин незализа ининиашш трансляпин обусловлен свойствами самого 5'-ИТР РНК ВЭНК, солер;паиего набор особых пис-элементов, образушнх так называвши 1EES (от англ. internal К1Ь02ошэ Entry Site) - сайт внутреннего связывания рибосомы. РНК езнк является ояноа из наиболее активных ыатшп, тганслирувкнхся в бесклеточннх системах из клеток мпекопитаваих (HeLa, КРЄ6С2, РЄТИКУЛОЦИТОВ) . Кроіїє того, при вирусной инФекпии РНК взик способна вытеснять клеточные КРНК из полисом и тем caifflu специфически ннгибнвовать трансляцию клеточных ыатвип. это предполагает наличие более высокого сродства неких компонентов трансляционного аппарата клетки,например, Факторов инициации трансляции, к рнк БЗИК, что лает ей преимущество перед клеточннни uphk в связывании с ркбосоыами.
отсутствие кеп-структуры у РНК ЕЗ!ЛК и, соответственно,
зависимости трансляции этой РНК от кеп-связывающих «акторов,
позволяет предполагать участие в процессе внутренней инициации
трансляция РНК ЕЗШ пошшо обычных Факторов иншшапни также и
специфических по отношению к данной РНК клеточных транс-
Фактогов, возможно, опосрєдуеших взаішопействие патрицы с
рибосомой или с Факторами инициации трансляции, наличие таких
транс-Факторов открыло бы широкие перспективы в исследовании их
роли в собственных клеточных процессах, в том числе и в
экспрессии клеточных цРНК.использугшик механизм внутренней
инициации. ...
Дель и задачи исследования: К ыоыенту начала нашей работы была предсказана вторичная структура лля 5і-нетранслируемых районов РНК некоторых пикорнавирусов. Согласно созданный моделям, подтверждаемым экспериментально,лилерные последовательности пикорнэеирусных РНК обладают сложней
ВТОРИЧНОЙ СТРУКТУРОЙ (СЫ. РИС. 1].
^___ Л6УМТ
Рис. I Вторичная структура 5' -НТР РНК ЕЭМК «согласно РіНрєпКо et. al. , 1989). Раикаыи указаны делении участков последовательности 5'-НТР в некоторых конструкциях. I, II», п III IV, - "субдомены" вторичной структуры 5'-НТР.
Ряд данных свидетельствовал также о важности вторичной структуры для Функциональной активности пис-злементов й'-нтр РНК. отвечавших за способность этих РНК к использованию внутреннего механизма ишшиании трансляции. Однако при этом оставалось неизвестным, какова роль сложной вторичной структуры 2
в обеспечении механизма внутренней инициации. Было высказано предположение о том, что элементы пространственной СТРУКТУРЫ IRES могут Формировать специфические сайты связывания Факторов инициации или неких особых клеточных транс-Факторов.
Целью настоящего исследования явилось изучение РНК-белковых взаимодействий в пределах 5'-нетранслигуемого района РНК вируса эннеФаломиокардита. которые, как предполагалось, имеют место как в клетках, так и в бесклеточных системах трансляпии,приготовленных на основе цитоплазыатических экстрактов из этих клеток. Кроме того, предполагалось изучение роли этих взаимодействий в процессе внутренней инициации трансляции данной РНК. Б холе выполнения работы были поставлены и решены следующие задачи:
-
Поиск и обнаружение клеточных белковых Факторов, спепийичееки взаимодействующих с последовательностью 5'-НТР РНК ВЭШ в экстрактах из клеток КРебс2.
-
Характеристика свойств таких белков и попытка определить, принадлежат ли последние к числу известных эукариотических Факторов инициации трансляции.
-
изучение особенностей взаимодействия специфических Факторов с указанными районами РНК, включая локализации районов последовательности 5'-НТР, необходимых и достаточных для их связывания.
-
Изучение влияния данных специфических РНК-белковых взаимодействий на способность 5'-НТР направлять инициацию трансляции РНК БЗЫК in vitro.
Научная новизна и практическая ценность работы. В работе впервые были обнаружены нРШ-связывающие белки из клеток млекопитающих, специфически связывающиеся с определенными участками 5'-нетранслируеыых районов РНК вируса зниеФаломиокардита и, вероятно, отвечавшие за обеспечение ее высокой трансляционной эффективности на уровне инициации трансляции, являясь белками, по-видимому, отличными от известных Факторов инициации, они могут претендовать на роль первого примера клеточных транс-Факторов, стимулирующих трансляцию определенных РНК в зукариотическнх системах на уровне стадии инициации (происходящей по неканоническому, внутреннему механизму) посредством специфического взаимодействия с особыми элементами 5'-НТР этих РНК. Данные исследования представляют собой новое направление в изучении механизма внутренней
ивнпиации у зукэриот. стратегия экспериментов, использованная і данной работе.может быть применена при изучении специфически; РНК-белковых взаимодействий,лежащих в основе многих вакнейшш клеточных ПРОПЄССОВ.
Апрдбаїшя работы: материалы диссертации были представлені на международном симпозиуме "Fost-transcrlPtional control oj gene expression", г. Гослар (ФРГ). 1990. международной конфєрєнпш "Protein bioWnthesls". г. пушино. 1991 и международной еколє-КОНФЄРЄНШШ іщо-febs asi "Post-tramcriptional control of беш ехргезаіоп".спепаи (грепияь 1S92.
структури и \об'ем диссертации: Диссертация состоит и: введения, трех глав^зыволов и списка литературы, она извожена на странипах\ содержит 18 рисунков и библиографически! список из названии.