Введение к работе
Актуальность проблемы. Ядра клеток эукариот представляют собой
высокоспециализированные органеллы, предназначенные для сохранения,
регулярного удвоения и упорядоченной передачи наследственной информации
на периферические эффекторные устройства. Соответствующие этим
функциям процессы репарации, репликации и транскринци ДНК,
протекающие в очень ограничеснном объеме ядра, должны строго
регулироваться. Структурно-функциональные аспекты такой регуляции
изучены недостаточно. Резистентность клеток обеспечивается
взаимодействием разветвленных репарационных систем, устраняющих потенциально летальные повреждения. Нерепарированные и нерепарируемые повреждения реализуются в мутагенные или летальные. Нарушение процессов репарации ДНК могут проявляться в виде различных клинических симптомов. Репарация и репликация ДНК интенсивно исследуются в связи с проблемами канцерогенеза старения и возникновения наследственных заболеваний. Важным ответом клетки на повреждения ДНК, является остановка продвижения клеток по циклу в контрольных точках G, и G2, что дает время для репарации ДНК до вступления клеток в фачы S и М. В последнее время активно исследуется участие специфического опухолевого суирессора р53 в осуществлении контроля клеточного цикла. Установлено, что после ДНК-повреждающих агентов, либо происходит р53 - зависимый блок клеточного цикла в G, и G2 фазах с последующим возобновлением пролиферации, либо наступает программированная клеточная гибель (апоптоз). Особый интерес представляет сравнительное исследование механизмов репарации ДНК и репликативного синтеза в клетках высших эукариот, различающихся по степени клеточной дифференциации. Имеющиеся в литературе данные по этому вопросу немногочисленны .и неоднозначны.
Цель и основные задачи исследования. Целью настоящей работы было проведение сравнительного исследования систем репарации и репликации ДНК в линиях клеток мыши, различающихся по степени дифференциации:
нейробластомы N-2a и фибробластов Lpq.
В работе были поставлены следующие конкретные задачи:
определить способность к выщеплению ПД из ДНК УФ-облученных клеток N-2a и Цэт;
исследовать летальное действие УФ-лучей на клетки клонов N-2a и L,w;
изучить эффективность и кинетику ПРР ДНК при УФ-облучении;
исследовать репликацию ДНК и влияние дсРНК на включение 3Н-тимидина в УФ-облученных клетках двух указанных клеточных линиях;
определить способность клеток N-2a и L,M к обходу повреждений на матрицах с повреждениями, вызванными УФ-облучением;
изучить восстановление митотического цикла в УФ-облученных клетках линий Lgj, и N-2a;
провести анализ полученного экспериментального материала для применения методов математического моделирования.
Научная новизна работы. Впервые проведено сравнительное исследование состояния систем репарации и репликации ДНК на молекулярном и клеточном уровнях в УФ-облученных линиях клеток, различающихся по степени дифференциации (нейробластомы N-2a и фибробластов L.m). Установлено, что клетки N-2a и Ljx,, резистентные к УФ-радиации по критерию выживаемости, практически не способны удалять из ДНК основной летальный фотопродукт - ПД. Интенсивность ПРР ДНК клеток N-2a превосходит таковую в клетках Lg^,, но в отличие от последних, N-2a не способны к беспрепятственному синтезу ДНК на поврежденной матрице через длительное время после действия УФ. Клетки нейробластомы N-2a оказались несравненно более чувствительными к действию УФ-облучения в отношении восстановления митотического цикла. По данным математического анализа экспериментального материала, процесс ПРР ДНК в обеих линиях клеток согласуется с гипотезой образования "пробелов".
Впервые представлены особенности влияния дсРНК на синтез ДНК в обеих клеточных линиях с отчетливо происходящим ннгибированием процесса включения эН-тимидина в ДНК на фоне повышения их выживаемости и эффективности клонирования.
Впервые предложена математическая модель репаративного ответа УФ-облученных клеток при прохождении клеточного цикла.
Практическое значение работы. Полученные результаты углубляют современные представления природы восстановления генетического материала в клетках с различной степенью дифференциации при действии УФ-радиации, что представляет не только существенный академический интерес, : j имеет также важное прикладное значение.
Выявление особенностей механизмов репарации и репликации ДНК в клетках высшей организации важно не только для лучшего понимания генетических основ канцерогенеза, старения, но и для правильной интерпретации явлений возникновения наследственных заболеваний и патологических состояний с наследственной предрасположенностью.
Изучение указанных процессов и изыскание путей воздействия на их развитие чрезвычайно важно в связи с направленной трансформацией оухариотической клетки и профилактикой мутагенного действия факторов внешней и внутренней сред организма. В настоящее время затронутым вопросам придается особое значение учитывая состояние постоянной изменчивости в окружающей среде фона излучений, качественных и количественных характеристик мутагенов химической и биологической природы.
С отмеченной точки зрения представляет несомненный интерес определение закономерностей поведения репарирующих систем с помощью математического моделирования.
Основные положения диссертации, выносимые иа защиту:
состояние систем репарации ДНК в клетках, раличающихся по степени дифференциации (нейробластомы и фибробластов мыши) при действии УФ-радиации
особенности репликации ДНК и митотический цикл в УФ-облученных вышеназванных клетках
математический анализ полученных результатов и математическая модель репаративного ответа клеток при прохождении ыитотического цикла.
Структура диссертации. Диссертация представленна на 125 страницах
русского текста, состоит из оглавления, введения, обзора литературы, описания методов исследования, результатов собственных исследований (5 глав), выводов, списка цитированной литературы (27 русских и 131 иностранных источников), 11 рисунков, 17 таблиц и списка использованных
сокращений.