Реконструкция цепи переноса электронов мембран хромаффинных гранул Бояджян, Анна Суреновна

Введение к работе

Актуальность проблемы. Ряд ключевых окислительно-восстановительных реакций кивой клетки протекает на ее мембранних структурах при участии влектронтралспортных цепей. Реакции эти имеют большой диапазон действия: с одной стороны, они принимают участие в биосинтезе макрооргичеоких и биоактивных соединений, с другой - в детоксификации ксенобиотиков, способствуя, таким образом, реализации многих кизненно вашшх функций организма.

Многочисленные експерименталыше данные свидетельствуют о ваысной структурно-функциональной и регуляторной роли липидов, в частности фосфолшшдов (ФЛ), в функционировании биологических цепей переноса электронов путем воздействия на входящие в состав этих цепей электронные переносчики и ферменты (French, Guenge-rioh, 1980; Robinson, 1982; Ахрзмидр., 1988, Balvers et al., 1993; Powell et al., 1990; Pinheiro. 1994; Chang et al., 1994; Ovadi et al., 1994; Rutomaa and Klrmunen, 1995; Cortese et al., 1995). Возмогшость осуществления подобных функций обусловлена тем, что липидное ыикроокружение является активным фактором, определяющим структурные, каталитические, динамические и соответственно функциональные особенности мембранных белков, как интегральных, так и периферических. Оно достаточно мобильно и днна?д»чно, чувствительно :: исуспспия. скругагцей среды, что в определенной степени достигается благодаря процессам флкп-флоп, латеральной диффузии, а самое главное - возможностям метаболических взаимопревращений компонентов лсшдного шпфоокрргения белка, переходом одних форм липидов в другие и, соответственно, изменением конформации этого микроокруаения. Модификация структурных и динамических свойств липидов способствует модификации структурных, динамических и каталитических свойств находящихся в их окружении белков (Бурлакова, 1977; Jost et al., 1977; Carru-ters, Melchior, 1986; Кшпшеп, 1991; Saltlel et al., 1991; Newton, 1993; Mouriteen, 1993; Marsh, 1995).

Предмете»! настоящего исследования являлась цепь переноса электронов мембран хромаффинных гранул (ХГ), природа, молекулярная организация и последовательность взаимодействия ев компонентов и роль липидного окружения в функционировании данной цепи.

XT представляют собой специализированные оубклеточные орга-нел"ы, локализованные в мозговом слое надпочечников и осущест-

- 4 -влякщке процессы накопления, хранения и секреции гормонов кате-холаминовой природы (Winkler et al., 1986). В ХГ протекает также одна из стадий биосинтеза хатехоламинов - реакция гидроксилиро-вания дофамина с образованием норядреналина, катализируемая медьсодержащим ферментом' - дофамин-р-монооксигеназой (ДБМ: КО 1.14.17.1) (Gkotlanu, I^ones, 1979; Stweart, Klinman. 1988).

Достаточное количество експериментальних данных (Flatmark et al., 1971; їегіапй, Platmrk, 1973; Zaremba, Hogue-Angeletti. 1982; Strivastava et al., 1984; Yfinkler et al., 1986; Wakefield et al., 1986; Stweart, IQiman, 1988; Perin et al., 1988: Евров-ti et al, 1989), позволяет предположить наличие на мембранах ХГ цепи переноса электронов, поставляющей необходимые для синтеза норадреналина восстановительные екзиваленты мембранной форме ДБМ (цДШ) и включающей следующую последовательность компонентов:

NADH -> ЙШ1:(акцептор)ре,щгктаза -> ?-> цнт.Ь_5б1-> ?->мДШ -> 0₂

дофамин 4 Ор -> норадреналин 4 HgO

Как следует из представленной схемы, состав компонентов влектронтранопоргной цепи идентифицирован не полностью. Б частности, не установлень! електронные переносчики, функцаонирущне на участках цепи мевду NADH;(акцептор) редуктазой и цитохроыом ^ь5б1 (Циг.Ьс^^). с одной стороны, и мевду шт.Ьь^,, и концевой оксидазой данной цепи - мДБМ. с другой.

В отношении последнего втапа -следует отметить, что еще в 1978г. в составе мембран ХГ был обнаружен кислый медьсодержащий белок (КМБ) (Helle et al., 1978), физиологическая роль которого до настоящего времени оставалась невыясненной. Белок этот был назван подобным образом исходя из низкого значения его изоэлектрической точки (3,5) и наличия в его составе меда (одного атома на молекулярную массу 10кДа (Григорян, 1983)). По своим физико- химическим свойствам втот белок может быть сравним о, так называемыми, "синими" медьсодержащими белками, функциони-рущиыи в составе цепей переноса електронов растений и бактерий и часто выступающими в роли акцепторов електронов цитохромов и доноров електронов концевых оксидаз (Сох, Boxer, 1978; Aikazyan, Nalbandyan, 1981; Adman, 1988; Nakamura, 1988; Treat et ul., 1988; Chen et al.. 1994: Ikeda, Sakura, 1994; Haikazyan, 1996).

Основные принципы структурно-функциональной организации ХГ "

- 5 -сходни о таковыми секреторных гранул, расположенных в других тканях, включая мозг. ХГ значительно крупнев аналогичных структур по размерам, и, кроме того, их несравненно легче получать методически. Шо позволяет рассматривать ХГ как идеальную модель для изучения сбщш принципов молекулярной организации и механизмов функционирования секреторных гранул в целом (Russel et al., 1985; Winkler et al., 1986; Sohwarzenbrunner et al., 1990).

В этой связи интересно, что некоторые из электронных переносчиков, характерные для электронтранспортной цепи мембран ХГ, бшіи гакне обнаружены в нейросекреторных гранулах окончаний ад-ренергических нейронов и нейрогипофкза (Russel et al., 19S5; Kent. Ilemlng, 1987; Solwarzenbrunner et al., 1990). Такім образом, но исключено, что сходныэ по структуро п молекулярной организации электронных, переносчиков, но отличающиеся природой концевой оксвдазы ьлектронтранспортные цепи могут функционировать и в составе других секреторных гранул, обеспечивая синтез тех или иных биоактивных еоединешій.

Учитывая вышеизлсаенное, очевидно,что исследования, направленные на изучение молекулярной организации цепи переноса елект-ронов мембран ХГ. последовательности взаимодействия составляющих ее компонентов, а такке той роли, которую играет липидаое oitpy-кение этих кошіонентов в функционировании отмеченной влектрон-транспортной цепи, играют существенную роль в ревении ряда фундаментальных проблем молекулярной биологии.-

Цель и задачи исследования. Первая задача настоящего исследования соотояла в идентификации недостающих звеньев в цепи переноса алектронов мембран ХГ и предполагала выяснение следующих вопросов:

1. Идентификация природного донора электронов цит.Ьсс-і!

2. Изучение возможности функционирования КМБ в цепи перекоса электронов мембран ХГ в качестве промеаутотаого звена на этапе переноса электронов от цит. bcg₁ к ыДШ.

Вторая задача настоящего исследования состояла в изучении воздействия М на реакции переноса электронов меаду компонентами электронтранспортной цепи мембран ХГ. Програмі, і исследований а пределах данной задачи включала:

3. Изучение воздействия йЛ на отдельные этапы переноса электронов;

4. Изучение молекулярных механизмов^ взаимодействия М с

концевой оковдазой цепи - мДШ.

Основные результаты и новизна полученных данных. В процессе поиска природного донора электронов цкт.Ъс^ среда компонентов ХГ, в мембранах етих органелл нами С5ыл обнаружен и выделен из них ранее неизвестный електроншй переносчик флавопротеидной природа. Разработан метод очистки, позволяющий получать флвво-протевд (ФП) в електрофоретически гомогенном состоянии, исследованы основные физико-химические свойства этого белка и сравнены со свойствами соответствующих митохондриальных п микр<~сомальных аналогов. Показано, что этот белок представляет собой гликопро-теид о молекулярной массой 140кДа, состоящий из двух нековалент-ио связанных оубъедишщ (53 и 37кДс) и содержащий две молекулы иековаленгло связанного ФАД на одну молекулу белка.

Изучены окислительно-восстановительные свойства СМ, его до--норно-акцепторше отношения с рядом неприродных и природных окислителей и восстановителей, в том числе и способность к взаимодействию с ioiT.bj-g... Показане возмокность переноса электронов от восстановленной формы ФП к окисленной форме UHT.bcg^. Установлено, что процесс взаимодействия Ш с октамерной молекулой цит.Ьссч специфичен, имеет положительно кооперативный характер со стехиометрией связывания 2:1. Показано, что в отличие от большинства электронных переносчиков флавопротеидной природы, обнарукенный нами белок не обладает ни NADH-, ни NADPH:(акцептор )редуктазной активностью.

Способность ФП выступать в роли донора электронов цит.Ь^.
с одной стороны, и отсутствие у него способности к взаимодейст
вию с NADH- или NADPH, с другой, позволяют сделать вывод о том,
что in vivo этот белок функционирует в составе цепи переноса
електронов мембран ХГ на участке меаду NADH:(акцептор)редуктазой
и цит.Ь_5б1. . ' .. -

Изучение ДОНОрНО-ВКЦеПТОрНЫХ ОГНОШеНИЙ UHT.bcgj, КМБ и мДШ

показвло способность КМБ сопрі.*енн:> функционировать в роли акцептора электронов цитохрома и донора электронов в реакциях, катализируемых ферментом. Показано, что окислительно-восстановительные реакции между КМБ, цит.Ьс^ и мДБМ специфичны, и что процесс взаимодействия между КМБ и октамерной молчкулой цитохрома имеет положительно кооперативный - характер со стехиометрией связываний 6:1. Установлено, что окислительно-восстановительные свойства ШЗ обусловлены наличием в его составе меди.

Результаты этой части экспериментов позволяют сделать вывод о том, что in vivo КЫБ функционирует в составе влектрснтрелс-портной цепи мембран ХГ моаду цнт.Ьс₁ н мДШ.

Следует отметить, что решешпо поставленной перед нами исследовательской задачи в значительной степени способствовала разработка мягкого метода очистка цит.Ь,-'^ позволяющего получать этот белок в его исходном лшщдном микроокрунешш в виде октамерного лшопротеидного комплекса - в состоянии ыекскмально приближенном к его структурной организации in vivo (Apps et al., 1984). Впервые был идентифицирован лншдный состав цитохроыа.

Результаты экспериментов по изучению влияния <М на отдельные этапы переноса электронов манну компонентами электронтранс-портной цепи мембран ХГ позволили установить специфическое моду-лируидее воздействие ряда Ш на резкиии переноса олектронов от цит.Ъ^., к КМБ, с одной стороны, и от КМВ к мДШ, о другой. Установлено, что одни &Л действуюг как активаторы, а другие - как ингибиторы по отношению к втим реакциям, что проявляется на уровне повышения или понижения эффективности и изменения кинетических параметров отмеченных реакций.

С учетом того, что in vivo больпшство из идентифицированных нами Л - модуляторов входит в состав липидаого ыикроокруке-ния UKT.0gg₁ и мДЙ.4 (Saxena, Fleming, 1981; Stweart, Klinman, 1988). получйннцв давние лплг.гтся о«яДбївльотвом рогуляторной роли фосфолшшдных компонентов мембран ХГ в функционнровашш входящей в состав втих мембран цепи переноса электронов.

Изучен процесс комшексообразованил цЦЕМ о шадивидуальными биполярными ФЛ, идентифицированным нами как активаторы фермента, а такзке с суммарной фракцией Л мембран ХГ. Исследовано влияние ряда факторов, в том числе рН, ионной силы, степени ассоциации-диссоциации субъединиц фермента, наличия или отсутствия в его составе атомов меди (фермент содержит 4 атома меди на тетра-мер с молекулярной массой 280кДа) на отмоченный процесс. Результаты экспериментов показали, что процесс ассоциации мДБМ с ФЛ обратим, специфичен и зависит от третичной и четвертичной структуры фермента. Показано, что наиболее аффективно процесс комп-лексообразования меаду ферментом и ФЛ происходит при рН, характерных для физиологических значений рН внугрі ХГ. У' -аяовлено, что в стабилизации комплекса фермент - фосфолипидная везикула пр.лимают участие как электростатические, так и гидрофобные

- 8 -взаимодействия. Проведен такке сравнительный анализ эффективности комплекоообразовадая мембранной и растворимой форы ДЕМ (рДШ), что позволило сделать вывод об участии гидрофобного пептида, входящего в состав мДШ и отсутствующего у рДШ (MoMahon et al.„ 1990; Bon et al., 1991; Gibson et al., 1993), в стабилизации комплекса фермент - ФЛ на мембране XT'.

Научно-практическое значение работы. Работа относится к числу фундамэнтальных исследований. В результате этих исследований из ыеыбран ХГ впервые выделен ранее неизвестные електронний переносчик флавохгротэидаой природы; установлены структурная организация втого белка и его физиологическая роль_е как компоненте цепи переноса електролов мембран ХГ, функционирующего на етало переноса электронов or NAM: (акцептор)редуктазы к циг.Ьс^.

Впервые показано, что, ранее обнаруженный в составе мембран ХГ КМБ способен функциотфовать в составе влектронтракспортной цепи втпх органелл в качестве промежуточного звена на етапе переноса 8ЛЄКТРОНОВ ОТ ЦИТ.ЬсС.1 к мДБМ.

С другой стороны, выяснение функциональной роли ФП и КМБ позволило идентифицировать недостающие звенья в цепи переноса электронов мембран ХГ.

Результаты настоящего исследования в значительной степени расширяют наш познания о составе и молекулярной организации цепи переноса электронов ыеыбран ХГ, при участии которой осуществляется один из ключевых этапов биосинтеза гормонов катехо-ламиновои природы. Впервые представлены данные, свидетельствующие о возможной регуляторной рола фосфолипидного микроокрукения компонентов влектронтранспортной цепи в отношении как промежуточных реакций переноса электронов, тек и завершающего втала -. гидроксилирования дофамина. Это открывают возможность целенаправленного поиска путей контролируемых воздействий на процесс биосинтеза гормонов и нейроыедиаторов катехоламиновой природа.

Представленные в работе даыше способствуют такке развитию современных представлений о структурно-функциональной организации биологических цепей переноса электронов и секреторных гранул, в целом, а кроме того, являются существенным вкладом в область исследования молекулярных механизмов и основных принципов липид - белковых взаимодействий.

Помимо этого, полученные в настоящей работе данные могут, служить хорооя» ориентиром и бить использовано; при выяснении

- 9 -структурно-функциональной взаимосвязи и идентификации компонентов електроптрпнспортной цепи нейросекреторшх гранул гипофиза (полный состав которой до настоящего времени но идентифицирован), где при участии цит.Ь,-^ и а-амидази - фермента, сходного с ДБМ по типу катализируемой реакции, протекает конечный этап образования активній форм циклических пептидных гормонов (Russel et al., 1985; Kent, Fleming, 1987).

Данные о молекулярних механизмах воздействия ФЛ па реакции переноса электронов и каталитические свойства ДЕМ, а также комп-лексообразования фермента с фосфолипидными везикулами могут быть использованы в исследованиях по изучению основных принципов, лежащих в основе липид-белковых взаимодействий, а также роли лшшдного микроокружения в функционировании цепей переноса электронов биологических мембран.

По ходу проведения настоящего исследования разработаны эффективные процедуры очистки ряда мембраносвязашшх электронных переносчиков и ферментов ХГ; найдены новые методические подходы к постановке экспериментов в модельных системах белок - фосфоли-пидная везикула. Отмеченные разработки могут быть применены в ряде областей экспериментальной биологии.

Полученные данные могут быть включены в ооответствувдие разделы преподавания курсов молекулярной биологии, нейрохимии, биохимии, биофизики и эндокринологии.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы н вошедшие в нее материалы были долокены и обсуадены на заседаниях Ученого Совета Института Молекулярной Биологии НАН'РА (Ереван, 1996) и Отделения Биологических Наук НАН РА (1991, Ереван), на ряде Республиканских и Всесоюзных конференций, на Международном съезде,посвященном нейрохимическим аспектам метаболизма фос-фолипидов (Перуджиа, 1988), на XIX съезде. ФЕБС (Рим, '1989), на II Международном конгрессе по Теоретической Органической Химии (Торонто, 1990), на VIII съезде Европейского Нейрохимического Общества (Лейпциг, 1990), на II съезде Азиатского Нейрохимического Общества (Хайдрабад, 1994), на VIII Международной симпозиуме по Биологии Хромаффйнных Клеток (Эдинбург, 1995).

Публикации. Основные результаты исследований отрааены в 21 печатных работах.

Обьем и структура диссертации. Работа излокена на Ю страницах машинописного текста, иллюстрирована 14 таблицами и 37

- 10 -рисунками. Построена по монографическом/ плану и состоят из введения, обзора литературы, описания методов исследования, двух глав, содержащих изложение результатов собственных исследования и их обсуждения, заключения к первой из них, общих выводов и указателя литературы, содержащего 211 источников.