Введение к работе
Актуальность проблемы
Цнтокиїїами называются белки, обладающие регуляторними функциями, которые проявляются в их ауто-, пара- и эндокринном действиях путем взаимодействия со специфическими рецепторами на поверхности клетки. Результатом подобных взаимодействий являются активация, дифферениировка или уничтожение клеток-мишеней. Фактор некроза опухолей (ФНО) - цитокин, продуцируемый, в основном, макрофагами, хотя известны и другие типы клеток, способных к его экспрессии (см. обзоры Beutler Ь Ceraml, 1989; Fiers, 1991; Beutler & Grau, 1993; Beyaert & Fiers, 1993). Первоначальный интерес к ФНО был обусловлен проявляемым им антиопухолевым действием In vitro и In vivo. После клонирования гена ФНО и очистки кодируемого им рекомбинантного белка стало понятно, что биологическое действие ФНО распространяется и на нормальные клетки. Изучение токсического действия бактериальных эндотоксинов «а клетки привело к пониманию роли ФНО в возникновении токсического шока и сепсиса. Применение ФНО в терапии рака ограничено, прежде всего, возникающей при высоких дозах ФНО системной токсичностью. Значительный уровень циркулирующего ФНО наблюдался также у больные церебральной малярией, причем терапия с использованием антител X ФНО способствовала уменьшению церебральных осложнений. Кроме того, ФНО играет роль в патофизиологических событиях, наблюдающихся при ряде аутоиммунных заболеваний (например, развитие ревматоидного артрита). С другой стороны, неоднократно было показано, что ФНО в соответствующих небольших дозах является важным медиатором защитной реакции организма при различных инфекциях. Тахим образом, ФНО может проявлять как защитные, так и вредные эффекты в зависимости от продуцируемого количества и периода времени, в течение которого эта продукция поддерживалась. Поэтому для применения ФНО в медицине необходимо понимание молекулярных механизмов биосинтеза ФНО и процессов, регулируемых его белковым продуктом.
Экспрессия гена ФНО регулируется на всех уровнях передачи информации: на уровне транскрипции, процессинга и времени жизни мРНК, трансляции и поеттрансляционно. Ранее было показано, что обработка макрофагов различными активаторами приводит к быстрой активации транскрипции гена ФНО. Однако попытки функционально охарактеризовать регуляторные элементы предпромоторной области гена ФНО приводили к неоднозначным результатам. Более того, существовали прямые противоречия между результатами исследований промоторов генов ФНО мыши и человека, обладающих высокой гомологией.
Цель к задачи работы
Цель данного исследования состояла в изучении индукции транскрипции гена ФНО человека в моноцитах и макрофагах различными активаторами и в определении роли отдельных регуляторних элементов предпромоторной области гена ФИО человека в регуляции его транскрипции. Были поставлены следующие задачи:
-
Исследовать влияние различных активаторов на уровень экспрессии гена ФНО человека в системе костно-мозговых макрофагов мыши и зрелых моноцитов человека.
-
Определить участки предпромоторной области гена ФНО человека, необходимые для обеспечения индуцированной транскрипции гена при действии различных активаторов, и функционально охарактеризовать регуляторные элементы, расположенные в этих участках.
-
Определить белковый состав комплексов, связывающихся с регуляторними элементами из предпромоторной области гена ФНО в ядерных экстрактах из моноцитов и макрофагов.
-
Охарактеризовать биохимические компоненты путей передачи внутриклеточных сигналов, приводящих к активации гена ФНО в моноцитах и макрофагах.
Научная новизна и практическая значимость работы Систематически исследовано влияние различных активаторов на уровень экспрессии гена ФНО человека в моноцитах (линия клеток Mono Мас б) и макрофагах (линия клеток ANA-1). Получен набор уникальных генно-инженерных конструкций (5'-делеционные и сайт-специфические мутанты предпромоторной области гена ФНО человека), позволивший выявить участки промотора гена ФНО, необходимые для его индуцированной транскрипции. Функционально охарактеризованы регуляторные элементы, расположенные в этих участках, и определен белковый состав комплексов, связывающихся с этими регуляторними элементами. Показана основная роль белков семейства NF-kB/RbI в индуцированной липополисахарилом (LPS) транскрипции гена ФНО человека, чем снято противоречие между результатами предшествующих исследований промоторов генов ФНО мыши и человека. Изучена активация гена ФНО в моноцитах и макрофагах форболовыми эфирами (РМЛ), показано участие протеинкиназы С в одном из механизмов передачи внутриклеточных сигналов, приводящих к индуцированной транскрипции гена ФНО.
Апробация работы
Результаты работы были представлены на следующих симпозиумах и конференциях: симпозиум Транскрипция: факторы, регуляция и диффсренцировка* (Кнстоун, США, январь 1993), 9 Международный симпозиум по онкогенам (Фредерик, США, июнь 1993), 5S Симпозиум по количественной биологии (Колл Спринт Харбор, США, июнь 1993), конференция Института молекулярной биологии им. В А. Энгельгардта РАН с участием International Advisory Board (Москва, декабрь 1993), 5 Международный конгресс по ФНО (Монтерей, США, июнь 1994).
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 4 печатных работы.
Объем я структура работы
.Диссертация изложена на 125 страницах машинописного текста и состоит из следующих частей: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, полученные результаты и обсуждение, выводы, список литературы. Библиография включает в себя 160 источника, работа проиллюстрирована 19 рисунками и 3 таблицами.