Введение к работе
Актуальность проблемы. Вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) является ггиологическим агентом синдрома приобретенного иммунодефицита(СПИД) — жкелого расстройства иммунной системы, сопровождающегося развитием шпортунистических инфекций и неопластических образований, неизбежно приводящих : летальному исходу.
В настоящее время в число основных задач медицинской вирусологии входит >азраболса эффективных подходов, позволящих диагностировать и прогнозировать инамику развития згболепания. Одним из аспектов этой проблемы является изучение шмунного ответа к регуляторним белкам ВИЧ-1. Появление или исчезновение антител : неструктурным белкам в сыворотках ВИЧ—инфицированных лиц может иметь «ачение для прогнозирования развития заболезания. Эта проблема в настоящее время інтенсивно исследуется. Детекция антител к VIF-белку, одному из регуляторных беяков 5ГЇЧ—1, является одним из направлений подобных исследований. Этот белок интересен чм, что по данным, полученным in vitro, усиливает инфехциоиность вируса в іекоторьк линиях лимфоидных клеток, а такаю лимфоцитах периферической крови. Этот факт, а также наличие открытой рамки считывания vif среди практически всех іентивирусов животных дает возможность считать VIF—белок существенным для інфехции in vivo.
Однако, уровень синтеза натквното VIF-белка в инфицированных клетках райне низок, что делает невозможным использование его в качестве антигена в [ммуиологических реакциях. Одним из способов преодоления указанного затруднения вляется получение препаративных количеств данного белка с помощью клонирования єна vif в удобной для экспрессии системе. Реконбинантный VIF—белок может быть [спольэсзан для скрининга ВИЧ-повожйтельних человеческих сывороток на ірисутствие VIF-специфических антител.
Цели и задача^ исследования. .Основной, цепью настоящЗй работы явилась
азработка способов детекции антител к белку VIF, одному из регуляториых белков
1ИЧ-1. ." .'..
В связи с этим в задачи исследования входило:
1. Конструирование рекомбинантных , плазмид, содержащих полную
оследозательность гена vif ВИЧ-І, и детерминирующих синтез реконібинантного
елка. .-......
2. Изучение экспрессии гибридных гшазмид, содержащих ген vif, в бактериях
l.coli и дрожжах S.cerevisiae.
3. Определение потенциальных иммуногенных детерминант по амино-кислотт
последовательности белка VIF ВИЧ—1 и химический синтез пептида, соответствуют
выбранной потенциальной иммуногеиной детерминанте. *
-
Получение сывороток животных, используя для иммунизации рекомбинантн белок к синтетический пептид. Исследование реактивности VIF-специфичес сывороток и применение их для анализа рехомбинантного вирусного антигена.
-
Исследование ВИЧ-позитивных человеческих сывороток на наличие антите. VIF-белку двумя иммунологическими методами тестироваиия(ИФА и иммуноблот использованием рекомбииантного антигена и их сравнительный анализ.
Научная ішзкзкз работы. В результате проведенной работы на основе дрожжеві и бактериального вектороз были получены ргкомбинаншые плаз.\щды, содержал полную последовательность гена vif под контролем сильного промотора. Анаї экспрессии рекомбинактиой бактериальной плазмвды поволіхя установить, что клетках Eccli происходит синтез гибридного полипептида, N—конец которі представляет собой Еминокисясткую последовательность балка—ггоситаяя, а С—конеї аминокислотную последовательность VIF—белка ВИЧ-1. Полученный пат.іпегп способен связываться с антителами к ВИЧ—1. Гибридный белок, «штезирующийс; бактериях Ecoli, состсвлясг до 15 тотального белка клетки и образует "тей: включения", что значительно упрощает их выделение и очистку для далькчщ исследований. Исследована Експрессия рекомбиншгшой дргазеевой гшазмиды некоторые свойства ее повгаеіша в клетках S.cerevisias. Определена иммуноггт детсрмикйігга в С-концесой чгсти \1Р-белка(с 155 по 16S амккшклотный сстатс Изучены иммунологические сиейства рекомбншшткого белка VIF ВИЧ—1.
Практическое значение работы заключается в использовании получен» рекомбинантного VIF—белка дал изучения гуморального їшмунного ответа ВИ' инфицированных лиц методом непрямого ИФА и иммуноблога.
На їзіцмту выносятся следующие положения:
1. Анализ зкепрессии полученной рекомбинантной гмазмиды YEpVIF в клеті дрожжей S.cercvisiae не выявил продукт вирусного гена ни в цитоплазме клеток, ні культуральной жидкости, вероятно, вследствии либо прочной ассоциации нерастворимой клеточной мембраной дрожжей, либо из—за блокировки экспрессии ге или на стадии транскрипции, или на стадии трансляции.
2. Сконструированная рекомбинантная плазмида pGEX—2TV обеспечивала в
ках бактерий Е.соїі синтез гибридного полипептида, способного взаимодействовать
вороткахш ВИЧ—инфицированных лиц.
3. В результате компьютерного анализа в С-концевой части VIF—белка ВИЧ-1(
— 168 аминокислотные остатки) выявлен потенциально иммуногенный участок,
гетический пептид, соответсвующий данному эпитопу, индуцировал образование
тел у кроликов, специфически взаимодействующих с рекомбинантным VIF—
ом, синтезированным в клетках Е.соїі.
4. Препараты злектрофоретически чистого рекомбинантного белка V1F при
унизащш кроликов шщуцировали образование еысокого уровня антител, способных
;нфично взаимодействовать с синтетическим пептидом.
5. Разработанные лабораторные варианты иммуноферментного анатиза и
уноблотз на основе полученного рекомбішантного белка позволяют выявить
[тела к VIF-белку в исследуемых сыворотках. Показано,' что 23% исследованных
[-позитивных человеческих сывороток специфически реагировало с гибридным
-белком.
Апробация работы. Результаты работы бьии представлены на юбилейной научно— ггической конференции, посвященной 70 -детию Института им.Пастера в г.С— :рбурге(1993 г.) и на 2 —ой Мегсдународной конференции "AIDS, cancer and Human viruses" в С—Петербурге (1993 г.)
Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора ратуры, экспериментальной части, обсуждения полученных результатов, заключения вводов. Объем работы составляет 103 страниц машинописного текста. Полученные льтаты иллюстрированы 4 таблицами и 15 рисунками. Список литературы авляет 81 наименование.