Введение к работе
Актуальность проблнни В настоящее время разработаны и применяются системы экспрессии в клетках эукариот, основанные на использовании систем репликации и транскрипции различных вирусов, геном которых состоит как из РНК, так и из ДНК (например вируса осповахцины, бакуло- и адено-вирусы, вирус саркомы Рауса, обезьяний вирус 40, вирус гепатита дельта, полиовирусы). Использование альфавирусов для экспрессии белков имеет несколько преимуществ, по сравнению с другими вирусами: а) альфавирусы могут инфицировать широкий спектр клеток, включая клетки ' насекомых, птиц и позвоночных, что позволяет изучать процессинг белков в разных клетках без получения разных рекомбинантных вирусов; б) могут быть синтезированы большие количества цитоплазматических РНК и белков; в) полноразмерные кДНК копии для получения in vitro инфекционных РНК-транскриптов получены для нескольких альфавирусов, включая вирусы Росс-Ривер, Леса Семлики, Синдбис и Венесуэльского энцефаломиелита лошадей (VEE); эти копии позволяют быстро конструировать рекомбинантные молекулы РНК; г) для вируса Синдбис получен и охарактеризован набор мутантов, позволяющих модулировать свойства рекомбинантных вирусов. Для вируса VEE разработаны живые вакцинные штаммы, что в будущем может позволить использовать систему экспрессии, основанную на вакцинном штамме, для применения в качестве вакцины. Все это показывает перспективность разработки систем экспрессии, основанных на геноме альфавирусов.
Ко времени начала работы были опубликованы только две статьи, посвященные разработке системы экспрессии на основе вируса Синдбис с использованием дефектных интерферирующих вирусных частиц. Согласно последним публикациям из известных альфавирусов наиболее активно развиваются разработка и применение систем экспрессии, основанных на вирусах Синдбис и Леса Семлики. Причем для вируса Синдбис разрабатывают* все стратегии экспрессии, а для вируса Леса Семлики только стратегия, основанная на использовании двух дефектных РНК, одна из которых не способна направлять синтез
структурных белков, а другая кодирует только их и не способна упаковываться в вирион.
Цель роботы. В задачи настоящей работы входило конструирование полноразмерных ДНК-копий рекомбинантных вирусов на основе вируса VEE, получение РНК, и, на этой основе, получение инфекционных вирусов и изучение их свойств. Основной целью данного исследования являлась разработка системы экспрессии белков на основе генетического аппарата вируса VEE.
Научная новизна в практическая ценность работы. В результате проведенной работы сконструирован набор рекомбинантных плазмид, несущих полноразмерную кДНК вируса VEE со встроенным геном рге-Si-S вируса гепатита В, на матрице этих плазмид синтезирована инфекционная РНК и получены рекомбинантчые вирусы.
Впервые определен участок генома вируса VEE, вставка в который чужеродного гена приводит к его эффективной экспрессии. Показано, что механизм функционирования 26S промотора вируса VEE отличается от других альфавирусов.
На основе анализа полученных данных построена модель вторичной структуры 26S промотора альфавирусов и сформулированы условия, необходимые для его функционирования.
Изучена стабильность разработанной системы экспрессии при пассировании на культуре клеток и способность, экспрессировать целевой продукт как in. vitro, так и in.vivo. Показано, что иммунизация животных рекомбинантным вирусом приводит к синтезу специфических к целевому продукту антител.
Изучено влияние вставки на биологические свойства рекоибииантного вируса. Обнаружено, что встройка дополнительного генетического материала в геном вируса по крайней мере ие приводит к увеличению его патогенных свойств для животных, при сохранении .выхода вируса при заражении культуры клеток.
В качестве практического применения отработана методика выделения HBsAg из инфицированных рекоыбинантным вирусом клеток. Показано, что HBsAg, полученный таким путем, можно с успехом применять в иммуноферыентных тест-системах.
Объеи и структура джхертацзш. Диссертация состоит из введения и трех глаз; Литературного обзора по структуре и репликации альфавирусов и векторным системам, основанным на их геноме (Гд&ва
1), Материалов и Методов Исследования (Глава 2), Результатов и их
обсуждения (Глава 3), заключения, выводов и списка цитированной
литературы (89 ссылок). Работа изложена на страницах
машинописного текста, включает 24 рисунка и 6 таблицы.
Лопробашш работы. Материалы диссертации докладывались на межведомственной конференции "Изучение и профилактика особо опасных вирусных инфекции" (Кольцове, 1993), IX Международном Конгрессе по Вирусологии (Glasgow. United Kingdom. 1993).
По материалам диссертации опубликовано 2 работы.
Использованные сокращенна. VEE - вирус Венесуэльского энцефаломиелита лошадей, SIN - вирус Синдбис, SFV - вирус Леса Семлики. LD50 - 50% летальная доза. ЦПД - іщтопатичсское действие. HBsAg - поверхностный антиген вируса гепатита В, ПІДР -полимеразная цепная реакция.