Введение к работе
Актуальность проблема Бурное развитие методов иммунохимичес-кой диагностики в 1970-1980 гг. во многом связано с появлением различных видов иммуноферментного анализа (ИФА). ИФА значительно потеснил радиоиммунологический и другие иммунологические методы и начал внедряться в практику в широких масштабах, в том числе в СССР (Покровский В. И., Шебалина С. а ,1989).
Наиболее важными областями применения твердофазного ИФА (тИФА) в медицине в настоящее время являются диагностика инфекционных заболеваний человека, выявление возбудителей в объектах . внешней среды, контроль банков крови и лекарственных препаратов. Более значимой становится роль тИФА в диагностике неинфекционных заболеваний человека, прежде всего в онкологии;, аллергологии и кардиологии, а также при оценке иммунного, биохимического и гормонального статусов (Егоров А. М. ,1988).
В связи с тем, что в настоящее время спектр объектов диагностики постоянно расширяется и имеется значительное отставание в производстве и внедрении в практику иммуноферментных (ИФ) тест-систем в СССР, весьма актуальным является вопрос разработки универсальных методических подходов к созданию ИФ диагностикумов.
Цель исследования. На ряде имеющих практическую ценность антигенов различного происхождения с использованием современных мо-лекулярно-биологических методов и биотехнологических приемов разработать общие подходы к созданию диагностических ИФ тест-систем.
Задачи исследования:
-
В применении к различным антигенам (таблица 1) исследовать эффективность и рациональность использования различных методов получения и очистки иммуноспецифических компонентов для проведения тИФА (антигенов, антител, ИФ конъюгатов) и разработать подходы к оценке их специфичности.
-
Разработать ИФ тест-системы для диагностики ряда инфекци энных и неинфекционных заболеваний человека, провести их расширен иую апробацию на клиническом материале и оценить возможности при кенения и перспективы внедрения.
Научная новизна проведенных исследований.
Разработаны ИФ тест-системы для выявления (IBsAg и антител к !ему, антигена ротавирусов группы А, соматических ^антигенов шй "елл зонне и флекснера II типа, определения уровня общего и специ ?ического IgE, 0;>-микроглобулина и плацентарной палочной фоофатчян іеловека на основе различных схем тИФА.
Таблица 1 Краткая характеристика антигенов, избранных для разработки диагностических ИФ тест-систем.
Антиген (антитела к нему)
Диагносцируеше заболевания
Ссылка на
литературный
источник
I.
Вирусный гепатит В
Ротавирусные инфекции Esters М. К. человека и животных et al.(1979)
1.
2.
3.
П. 1.
2.
Вирусные антигены: HBsAg (поверхностный антиген вируса гепатита В) Анти-НВзАя-антитела классов G и Ы человека' Группоспецифический антиген ротавирусов,группы А Бактериальные антигены: Соматический С-антиген шигелл зонне Соматический О-антиген шигелл флекснера II типа III. Антигены человека:
-
Иммуноглобулины классов. G, М И А
-
Иммуноглобулин Е (общий и специфический)
-
0 2 - микроглобулин (бета-2-М)
-
Плацентарная палочная фосфатаза (ЩФ)
Дизентерия Зонне Дизентерия Флекснера
Иммунодефицитные состояния, гаммапатии и др. Атопические аллергические и паразитарные заболевания
Аутоиммунные и воспалительные заболевания Неопластические заболевания
Жданов Е Ы. И др. (1986).
Хазенсон Л.Е Чайка ЕА. (1987)
Lems-Van Kat et al.(1983' Адо А.Д. (1978)
Аметов А. С. и др. (1984) Pol let D.E. et al. (1985;
Отработаны методы очистки иммуноспецифических компонентой (антигенов, антител) применительно к созданным ИФ тест-системам и предложены ИФ подходы к оценке их специфичности.
Разработаны методические подходы для применения бета-лактама-зы при создании ИФ тест-систем с возможностью визуальной регистрации результатов анализа. Разработан метод приготовления конгюгатов бетн лпктамя-ш с антителами и антигенами.
Разработаны общие методические подходы к созданию лабораторv ых вариантов ИФ диагностикумов и внедрению их в клиническую прак-ику в виде ИФ тест-наборов.
Практическая значимость работы.
На основе методов и подходов тИФА созданы тест-системы, имею ідие практическую ценность для диагностики ряда инфекционных и неинфекционных заболеваний человека.
Проведена клиническая апробация созданных ИФ тест-систем. Исследована чувствительность и специфичность разработанных тест-систем в сравнении с коммерческими диагностикумами.
Разработанная методология наработки препаратов поликлональных антител к бактериальным антигенам с помощью аффинной хроматографии может быть использована для создания иммунодиагностикушв. предназначенных для определения бактериальных антигенов. Предложенные методы получения иммуноспецифических компонентов позволяют опти- -мально решить проблему выбора схемы определения антигенов с требуемой степенью чувствительности и специфичности, обусловленной клиническими задачами.
Разработанная методика синтеза конъюгатов антител и антигенов с бета-лактамазой на основе периодатного метода перспективна для создания ИФ тест-систем с визуальным учетом результатов тИФА.
Внедрение результатов работы.
По результатам работы составлено и утверждено 22.05.1989 г. Фармакопейным комитетом ИЗ СССР изменение N3 к ВФС 42-24ВС-86 "Тест-система иммуноферментная для определения HBs-антигена", утверждены 31.12.1987 г. Госагропромом СССР "Технические условия производства диагностических иммуноферментных тест-систем для детекции шигелл зонне и флекснера". ИФ набор для диагностики ротави-русной инфекции утвержден 12.07.1990 г. Комитетом МИБП для проведения государственных испытаний.
ИФ наборы для определения О-антигенов шигелл были исполь8ова-вы для диагностики дизентерии в клинических учреждениях городов Москвы, Уссурийска, Тюмени, Рудного и Ашхабада ИФ тест-система для определения уровней общего и специфического IgE человека была внедрена в клиническую практику НИИ педиатрии АМН СССР и городской клинической больницы N 60 г. Москвы. Положительные отзывы о ревуль татах клинического использования ИФ набора для выявления HBsAg бы ли получены из клинической больницы N6 и I инфекционной больницы г. Москвы, областной СЭС г. Калининграда.
-4.-
Апробация работы.
Результаты проведенных исследований и отдельные фрагменты доложены и обсуждены на заседании Московского научного общества инфекционистов (1987 г.), Всесоюзном семинаре "Иммуномодуляторы и их значение в инфекционной и неинфекционной патологии (Москва, 1987 г.) Международном симпозиуме "Advances in enzyme regulation" (Индиана-полис, США, 1987 г.), VI Всесоюзном симпозиуме "Инженерная энзимо-логия" (Вильнюс, 1988 г.), III Всероссийском съезде инфекционистов (Москва-Смоленск, 1989 г.), 19-ом конгрессе FEBS (Рим, Италия, 1989).
В завершенном виде диссертационная работа апробирована 25 октября 1990 г. на конференции отдела экологии и диагностики Научного центра по разработке и внедрению современных мет"одов молекулярной диагностики МЭ СССР.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 научных работ.
Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, трех глав обзора литературы, трех глав изложения собственных исследований и их результатов, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на ІНВ страницах машинописного текста, содержит