Введение к работе
Актуальность проблемы. Биосинтез белка на рибосомах - один аз наиболее важных и интересных клеточных процессов. Изучение зго представляет собой фундаментальную задачу молекулярной био-яогии. Уже более 30 лет ведутся интенсивные исследования этого процесса с помощью разнообразных физических и биохимических методов. Но,несмотря на то, что основные этапы и многие детали зго шгаю считать установленными, остается целый ряд неразре-аенных вопросов и проблем, связанных с процессом трансляции в целом и с работой рибосомы.
Удлинение растущего пептида на одну амінокислоту происходит в ходе одного элонгациовдого цикла. Важным шагом в понимании механизмов работы рибосомы явилось изучение взаимодействия рибосом с различными компонентами, участниками элонгации, и в первую очередь с тРНК. На сегодащний день определено количество сайтов связывания тРНК на рибосомах, их структурная организация, функциональная роль, измерены основные кинетические и термодинамические яарэ"етры взаимодействия различных форм тРНК (аминоацил-, пептидил- и деацшмрованной) с каадым сайтом. В последнее время особый интерес исследователей вызывает изучение комплексов [рибосома-мРНК-тРНК], отражающих конкретное функциональное состояние рибосомы в определенный момент элонгационного цикла, например, пре- и посттранспептидационное, пре- и пост-транслокационное .
Общепринято, что в претранслокационном комплексе вновь синтезированная в рибосоме пептидил-тРНК находится в А сайте. В результате последующей транслокации ( EF-G-фактор-зависимой.
или "яеэнзиматической") пептидил-тРНК реремещается в Р сайт Это состояние является, соответственно, посттранслокадионным. ] модельних комплексах In vitro положение пептидил-тРНК на рибосоме, и, следовательно, состояние комплекса определяется, каї правило, по способности этой пептадал-тРНК реагировать с антибиотиком пуромщшгагл. Считается, что Р-сайт связанная пептидил-тРНК (т.е. в посттранслокационном комплексе) количественно образует петтдая-пуромэдин, а А-сайт связанная (т.е. в претранс-локаїпюнном ^яілаксе) - вообще не реагирует с вдромицшюм.
Кинетика реакции с пуромвдином для Р-сайт связанной пепти-дил-тР}Ц{ изучалась достаточно детально. Тем не менее,существуй различные точки зрения на необходимые условия ее проведения. 3 результате они варьируют в очень широких пределах. А поскольк; данные пуромициновой реакции используются для идентификацш сайтов, определения доли активных рибосом и доли рибосом в пре-и посттранслокационном состояниях, то в некоторых случаях применение определенных условий может привести к ошибочному представлению об рнализируемых комплексах.
Кроме того,следует отметить, что в действительности реакция с пурошшином дает информацию даиь о положении З'-концево! области пептидил-тРНК в рибосоме. Вследствие же многоцентровоіч взаимодействия тРНК и рибосомы в процессе элонгации возможн< нахождение тРНК в смешанных или гибридных состояниях, когда различные части молекулы находятся в разных сайтах рибосомы, что уже показано на основе структурных исследований различны: тРНК-рибосомальяых комплексов. В связи с этим,естественно, возникает вопрос о том, как вздет себя пептидал-ТРНК в таком состой;;;!, ннпример, по отношении к щромицшу И ВОЗМОКНО ЛИ (
помощью пурокпциновой реакции вдептифщировать это гибридное состояние тРНК в рибосоме.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось:
-
исследование кинет: ті реакции с пуромицяном пептидил-тРНК в пост- и пре транс локационном комплексах, причем как связанной с Р и А сайтам?! ркбосрм непосрэдственяо из раствора, так и образованной естественнгм путем в результате синтеза пептидной связи на рибосоме;
-
исследование стабильности синтезированной в рибосоме пептидил-тРНК в посттранслокациокном комплексе в отсутствии следующего шага элонгации.
Научная новизна и теоретическая ценность результатов. Впервые показано, что пептидил-тРНК может количественно реагировать с пуромицином без транслокации в Р сайт, оставаясь связанной с А сайтами 70S рибосом. Таким образом, функционально доказано существование гибридного состояния пептидил-тРНК на рибосоме, когда основная часть молекулы находится в А сайте, а ее 3'-конец в Р сайте пептидилтрансферазного центра.
Из сопоставления полученных данных с тлеющимися в литературе предложена новая схема событий, происходящих в рибосоме в процессе транспептидации.
Даны практические рекомендации по применению антибиотика пуромицина для определения положения пептидил-тРНК в рибосоме. Доказана необходимость кинетической дискриминации А и Р сайтов при идентификации их с помощью пуромициновой реакции.
При исследовании стабильности посттранслокационного комплекса обнаружено явление спонтанной терманации, происходящее пр:т длительной инкубации пептидил-тРНК, синтезированной в рибо-
- б -
соме и находящейся на Р-сайте при свободных А-сайтах.
Показано, что деацилированная тРНК, естественным образом полученная в рибосоме,имеет иные параметры взаимодействия с I сайтом, чем непосредственно связанная из раствора.
Теоретическое значение результатов состоит в уточнении механизмов транспептидации и транслокации в прокариотических рибосомах.
Апробация работы. Материалы работы докладывались на II-of международном симпозиуме "Молекулярная организация биологических структур" (Москва, 1939), на конференции Американского микробиологического оОщества по рибосоме (Монтана, США, 1989), ні международных конференциях "Регуляция трансляции" (Рига, 1989' и "Биосинтез белка" (Пуадшо, 1991).
Объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов, обсуждения результатов, списка литературы. Диссертационная работа изложена » 139 страницах, содержит 30 рисунков и 2 таблицы. Библиографи: включает І59 ссылок.