Введение к работе
Актуальность проблемы. Центральную роль в процессах жизнедеятельности клетки играют различные РНК-белковые комплексы. В большинстве своем, эти комплексы могут быть разделены на белковую и РНК составляющие при денатурирующих обработках, поскольку основаны на нековалентпых взаимодействиях. Однако, в клетке существуют и ковалентные комплексы белка и РНК. Примерно четвертая часть РНК-содержащнх вирусов эукариот имеет необычную структуру на 5'-конце РНК, выделенной из вирионов, - ковалентно присоединенный низкомолекулярным вирусный белок, называемый VPg (viral protein genome-linked), который играет важную роль в процессе вирусной репликации. По сравнению с вирусными ковалентными РНК-белковыми комплексами, их клеточные аналоги пока мало изучены. На сегодняшний день наиболее охарактеризован лишь комплекс, образованный 5.8S рРНК и продуктом клеточного антнонкогена белком р53. Также, ковалентный комплекс с РНК способен образовывать протимознн альфа (ПроТ а) - небольшой (13 кДа) эволюционно консервативный ядерный белок, в больших количествах обнаруживаемый в быстро делящихся клетках эукариот. В клетках асцитной карциномы Кребс 2 мыши ПроТ а ковалентно связан с неизвестной РНК длиной около 20 нуклеотидов. Подобные РНК-ПроТ а комплексы были найдены и в других эукариотических организмах. ПроТ а является жизненно важным белком, принимающим участие в клеточной пролиферации, однако конкретная функция и механизм действия ПроТ а до сих пор неизвестны. Установление иуклеотпдиой последовательности связанной с ПроТ а РНК могло бы пролить свет на его функции.
Если способность ПроТ а млекопитающих присоединять РНК является свойством самого белка, то возникает вопрос, не может ли рекомбинантный ПроТ а высших эукариот сохранять эту способность при продукции в клетках Е.соїі. В этом случае, введя в последовательность рекомбинантного ПроТ а небольшую модификацию, облегчающую выделение ПроТ а и его комплекса с РНК, такой комплекс можно будет получить в индивидуальном виде и исследовать.
Цель работы. Целью настоящей работы было установить, сохраняет ли ПроТ а высших
)укариот способность присоединять РНК в клетках Е.соїі, с какой РНК он может
шимодействовать, что представляет собой данный РНК-белковый комплекс и какие участки
і молекуле ПроТ а обеспечивают ему возможность присоединять к себе РНК.
Научная новизна и практическая ценность работы. В данной работе установлено,
гго рекомбинантный ПроТ а крысы и человека, синтезируемый в клетках Е.соїі, обладает :пособностью присоединять РНК. Таким образом, способность ПроТ а образовывать юмплекс с РНК является свойством самого белка, а не клеточного аппарата вьісшігх эукариот. Наличие гексагистндинового «тэга» у рекомбинантного ПроТ а ноіволило очистить и
охарактеризовать его комплекс с РНК. Был идентифицирован РНК-компонент образуемог комплекса: им оказался набор тРНК, которые присоединены к ПроТ <х своим 5'-копцом і имеют свободный 3'-конец. Присоединение тРНК к ПроТ а носит ковалентный характер.
Выявлено несколько независимых мест присоединения тРНК к ПроТ а локализованных вблизи N- и С-коицевых кластеров остатков основных аминокислот г молекуле ПроТ а. Отдельные фрагменты ПроТ а сохраняют способное!ь присоединять тРНК но необходимым условием образования комплекса, по-видимому, является наличие в белкі остатков основных аминокислот. Поскольку С-концевой кластер представляет собой сигнш ядерной локализации ПроТ а, то можно ожидать, что присоединение к нему большої отрицательно заряженной молекулы тРНК должно маскировать его и, таким образом, влияті на внутриклеточную локализацию ПроТ а в клетках эукариот.
Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано <
научїіьіе работы. Результаты исследований докладывались на VI Международно! конференции по биохимии и молекулярной биологии памяти Л.Л.Белозерского, Москва, 1995 на Международной конференции «The First Annual Meeting of The RNA Society», Мэдисон США, 1996 г., на II съезде Биохимического Общества РАН, Москва, 1997 г. и на 13-n Французско-Российском симпозиуме «Структура и регуляция эукарнотичеекмх генов» Монпелье, Франция, 1997.
Структура н объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы
результатов и обсуждения, экспериментальной части, выводов и списка цитируемо! литературы. Работа изложена на 140 страницах машинописного текста и содержит 3! рисунков и 5 таблиц. Список литературы включает более 100 источников публикаций.