Введение к работе
Актуальность темы. Пространственная структура биологически активных соединений является одним из основных факторов, определяющих особенности их функционального поведения на молекулярном уровне. Поэтому не удивительно, что основные фундаментальные успехи в области молекулярной биологии в значительной степени достигнуты благодаря результатам рентгеноструктурных исследований. В процессе жизнедеятельности биологических систем одна из ведущих ролей принадлежит нуклеиновым кислотам и их компонентам -нуклеозидам и нуклеотидам. Благодаря участию в метаболических процессах и взаимодействию с ключевыми ферментными системами, компоненты нуклеиновых кислот и их многочисленные производные имеют важное значение для поиска новых лекарственных веществ. Среди соединений этого класса обнаружены эффективные противовирусные, противоопухолевые, кардиотонические и иммуномодулирующие агенты.
Разработка научных основ целенаправленного поиска биологически активных соединений с заданным спектром активности является одной из главных задач современной молекулярной биологии, биоорганической химии и фармакологии. Решение этой задачи неразрывно связано со знанием пространственных структур исследуемых соединений и их корреляции с биологической активностью.
Основными химическими подходами при создании новых биологически активных аналогов нуклеозидов и нуклеотидов являются: а) замена или удаление функциональных групп в углеводном или гетероциклическом фрагментах ; б) замена углеводного компонента молекул ациклическим; в) создание конъюгатов с другими биологически активными соединениями; г) введение химически инертных заместителей (например, СНз-групп) вместо атомов водорода в углеводных фрагментах с сохранением всех функциональных групп, характерных для природных соединений.
Проведенные нами серии рентгеноструктурных исследований пространственного строения аналогов нуклеозидов охватывают почти все вышеприведенные типы модификаций. Однако, особое внимание нами уделено изучению закономерностей в строении молекул З'-замещенных 2',3'-дидезоксинуклеозидов, в число которых входят основные лекарственные соединения, используемые в медицинской практике для лечения больных СПИДом.
В настоящее время установлено, что нуклеотидные остатки У-трифосфатов некоторых З'-замещенных 2',3'-дидезоксинуклеозидов могут включаться в 3'-конец новосинтезируёмой цепи ДНК и, из-за отсутствия у них З'-гидроксила или же изменения его реакционной способности, прерывать (терминировать) ее дальнейшую элонгацию. В случае вирусов это влечет ингибирование их репродукции. Такие свойства З'-замещенных аналогов нуклеозидов широко используются для создания новых лекарственных препаратов, а также для фундаментальных исследований механизмов функционирования ДНК-полимераз различного происхожения.
Сродство и специфичность модифицированных нуклеозид-^-трифосфатов х тому или иному виду ДНК-полимераз зависит как от химического структуры заместителя в З'-положении, так и от пространственного строения молекулы в целом. В- целях выяснения стереохимических аспектов субстратной специфичности ряда ДНК-полимераз нами исследовано пространственное строение молекул конфориационно подвижных и хонформационно ограниченных, специфичных и неспецифичных терминаторов синтеза ДНК, подавляющих репродукцию рет-ровирусов, в том числе вирусов иммунодефицита человека (ВИЧ), изучена корреляция пространственных структур этих соединений с их биологической активностью, выявлены структурные закономерности, ответственные за узнавание и специфичность модифицированных нуклеозидов. Последнее крайне необходимо для организации целенаправленного поиска селективных ингибиторов обратных транскриптаз ретровирусов, включая ВИЧ.
Цель работы. Основной задачей настоящей работы было получение кристаллов и исследование методом рентгеноструктурного анализа пространственного строения молекул семи групп модифицированных нуклеозидов, включая известные антивирусные агенты, выявление основных конформационных закономерностей строения их молекул и установление корреляции между ' пространственной структурой и биологической активностью исследуемых классов соединений. Особое внимание в работе уделено изучению нескольких групп родительских нуклеозидов термияаторных субстратов ДНК-пояимераз различного происхождения с целью получения структурной информации для целенаправленного поиска новых эффективных блокаторов ВИЧ.
Научная новизна и практическая ценность
I. На основе рентгеноструктурных исследований впервые установлены пространственные структуры и получены конформационные параметры нескольких групп соединений: 1. Группы конформационно подвижных З'-замещенных 2',3'-дидезоксинуклео-зидов: блокатора репродукции ВИЧ 3'-азидо-2',3'-дидезокситимидина (ddT(3'N3), AZT), 5-трифосфат которого является специфичным ингибитором обратных транскриптаз, неспецифичного ингибитора биосинтеза ДНК З'-ами-но-2',3'-дидезокситимидина (ddT(3'NH2)) , 5'-трифосфат которого проявляет свойства терминаторного субстрата ДНК-полимераз различного происхождения, и его аналога 3'-метиламино-2',3'-дидезокситимидина (ddT(3'NHMe)), специфичных ингибиторов репродукции ВИЧ 3'-нитро-2',3'-дидезокситимидина (ddT((3TM02)), 3'-гидроксимино-2',3'-дидезокситимидина (ddT(3'=NOH)) и его метильного аналога 3'-метоксимино-2',3'-дидезокситимидина (ddT(3-NOMe)) , соединений с объемными ациклическими и циклическими заместителями З'-О-метилтиометил-2'-дезокситимидина (dT(3'OCH2SMe)), З'-О-метилсульфинил-метил-2'-дезокситимидина (dT(3'OCH2SOMe)), 3'-(тетраз6л-2"-ил)-2',3'-дидезок-ситимидина (ddT(3'tetr)) и 3'-(5"-метилтетразол-2"-ил)-2',3'-дидезокситимидина (ddT(3'tetr-5"Me)).
2. Конформационно ограниченных по фуранозному циклу блокаторов биосинтеза
ДНК: 2',3'-ликсоангидротимидина (1аТ), 2',3'-рибоангидроаденозина (гаА), 2',3'-
дидезокси-2\3'-дидегидротимидина (йлТ), З'-метил-г'-дезокситимидина (dT3'Me)
3. Конформационно подвижных и конформационно ограниченных соединений
с двойной модификацией по углеводному циклу : 3'-хлор,4'-метил-2',3'-дидезок-ситимидина (ddT(3'Cl,4'Me)), 4'-гшгроксиметил-2',3'-ликсоангидроцитидина (1аС(4'СН20Н)), 4'-гидроксиметил-2',3'-рибоангидроаденозина (гаА(4'СН20Н)), 3,(S)-MeTHn-3'(R)^Top-2'>3'-flHfle30KCHTHMHflKHa(ddT(3'Me,F)).
4. Группы диоксолановых аналогов 2',3'-дидезоксинуклеозидов: ^uc-4(R,S)-
гидроксиметил-2(8Д)-(тимин- 1-илметил)-1,3-диоксолана (4hc-4(R,S)T- 1,3ди-
окс), !*ис-2(К,8)-гидроксиметил-4(8Д)-(тимин-1-илметил)-1,3-диоксолана (цис-
2 (R,S)T-l,3flHOKc) и трда<с-4(К,8)-гидроксиметил-2(8Д)-(урацил-1-илметил)-1,3-
диоксолана (mpaHC-4(R,S)C-l ,Здиокс).
5. Аналогов нуклеозидов, в которых сохранены все функциональные группы
природных нуклеозидов, потенциально необходимые для связывания с фер
ментами биосинтеза нуклеиновых кислот: 2'-метилуридина (U(2'Me)), З'-ме-
тилцитидина (С(З'Ме)), 5'(К)-метилцитидина (C(5'(R)Me)), 5'(8)-метилцитидина
(C(5'(S)Me)), 5'(5)-метил-2-дезокситимидина (dT(5'(S)Me)) и Г-гидроксиметил-
цитидина (CXI'CHjOH)).
6. Ангидронуклеозидов с закрепленной си»-конформацией вокруг гликозидной
связи: 6,Г-ангидро-6-гидрокси-1-(2-В-0-псикофуранозил)цитозина (б.Г-О-аО) и
8,1'-ангидро-8-гидрокси-9-(2-р-П-псикофуранозил)аденина(8,Г-0-аАр).
7. Ациклических аналогов рибавирина и ацикловира, проявляющих различ
ную степень антигерпесной активности: 1-(2-гидроксиэтоксиметил)-1,2,4-
триазол-5-карбоксамида (5-НЕМТ), 1-(1,5-дигидрокси-3-оксапент-2-ил)-1,2,4-
триазол-5-карбоксамида (5-DHPT), 1-(2-гидроксиэтоксиметил)-1,2,4-триазол-З-карбоксамида (3-НЕМТ) и (8)-9-(2,3-дигидроксипропил) аденина ( (S)-DHPA):
-
Впервые определены пространственные структуры лекарственных соединений, используемых в медицинской практике для лечения больных СПИДом -3'-азидо-2',3'-дидезокситимидина ( зидовудина, ретровира, тимазида, AZT) и 2',3'-дидезокси-2',3'-дидегидр6тимидина (ставудина), проанализированы основные конформационные свойства этих соединений, ответственные за активность, включая конформационную подвижность молекул и ориентацию азидогруппы, имитирующую ориентацию гидроксигруппы природных нуклеозидов, в случае первого соединения и плоскостное строение углеводного цикла - в случае второго.
-
На основе стереохимических данных, полученных для конформационно ограниченных соединений 2',3'-дидезокси-2',3'-дидегидротимидина, 2',3'-ликсоан-гидротимидина и 2',3'-рибоангидроаденозина, показано, что высокое сродство и относительно низкая специфичность 5-трифосфатов 2',3'-дидезокси-2',3'-диде-гидронуклеотидов к различным ДНК-полимеразам, включая обратные транкриптазы ретровирусов, коррелируют с плоскостным строением их фу-ранозных циклов, которое, по-видимому, моделирует структуру природного dNTP в ДНК-синтезирущем комплексе. Выявлена пониженная субстратная специфичность обратных транскриптаз по сравнению с другими ДНК-полимеразами к различным конформационным состояниям субстрата.
IV. Изучено влияние на конформацию молекул нуклеозидов введения
вместо атомов водорода метальных заместителей по атомам углерода в 2'-, 3'- и 5-
положениях их углеводных фрагментов. Установлено увеличение длин С-О-связей
при всех метилированных атомах углерода в углеводных остатках, которое мо
жет приводить к уменьшению реакционной способности соответствующих
гидроксильных групп. Обнаружена конформационная ограниченность у З'-ме-
тшширимидиновых нуклеозидов, обусловленная стерическими затруднениями,
возникающими между атомами объемных метальных групп, расположенных над
углеводными циклами со стороны оснований, атомами оснований и атомами 5'-
гидроксиметильных групп. Дано возможное стереохимическое объяснение причин
наличия у 5*-трифосфатов З'-метилнуклеозидов свойств терминаторных суб
стратов в РНК-синтезирующих системах и отсутствие их в ДНК-синтезирующих
комплексах.
Полученный обширный рентгеноструктурный материал внесен в Международный Кристаллографический Банк Данных (Кембридж, Великобритания) и может служить структурной базой для целенаправленного конструирования и синтеза новых объектов с заданным спектром биологической активности, для фундаментальных и прикладных исследований в области биологии, химии и медицины.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на : I Всесоюзном Биофизическом Съезде (Москва, 1982); Всесоюзной конференции "Перспективы биоорганической химии в создании новых лекарственных препаратов" (Рига, 1982); VIII Международном Конгрессе Кристаллографов (Гамбург, ФРГ, 1984); IV и VI Всесоюзных совещаниях по органической кристаллохимии (Звенигород, 1984; Киев, 1991); VII Международном симпозиуме по химии компонентов нуклеиновых кислот (Бехине, ЧССР, 1987); Международном симпозиуме по компьютерным методам в молекулярном моделировании (Шлосс-Эльмау, ФРГ, 1988); Международной школе по трехмерной молекулярной структуре и действию лекарств (Эриче, Италия, 1989); Международном симпозиуме по органической кристаллохимии (Познань, Польша, 1989); XII Европейском совещании кристаллографов (Москва, 1989); Международном симпозиуме "Синтез' олигонуклеотидов, проблемы и границы практического
применения" (Москва, 1991); IV и V Международных конференциях по росту кристаллов биологических макромолекул (Фрайбург, Германия, 1991; Сан-Диего, США, 1993); Международной конференции "СПИД, рак и ретровирусы человека" (Санкт-Петербург, 1992); X и XI Международных круглых столах "Нуклеозиды, нуклеотиды и их биологическое применение" (Парк-сити, США, 1992; Лувен, Бельгия, 1994); XVI Европейском совещании кристаллографов (Лунд, Швеция, 1995).
Структура работы. Диссертация изложена в виде научного доклада. Основная часть результатов получена в соавторстве с Е.Н. Цапкиной, Г.М. Джавадо-вой, А.В. Бочкаревым, В.Е. Заводником. Вклад других соавторов отражен в публикациях по теме диссертации. Исследованные соединения были синтезированы в Институте молекулярной биологии РАН (в лабораториях А.А. Краевского, С.Н. Михайлова, Б.П. Готтиха и В.Л. Флорентьева), в Московской медицинской академии им. Сеченова (И.И. Федоров, Э.М. Казьмина), в Институте тонкой химической технологии (А.Д.Шуталев, Ю.Е. Райфельд), в Институте биоорганической химии им. М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова (С.Г.Завгородний), в Самарском государственном университете (А.В.Папчихин, П.П. Пурыгин). Всем коллегам приношу глубокую благодарность за участие в совместных работах. Искренне признательна А.А. Краевскому за постоянный интерес, поддержку и обсуждение работы.