Введение к работе
Актуальность проблемы Современный уровень зншпгй о белках, закономерностях, формирования их структуры и функции позволил исследователям перейти от пассивного изучения этих важнейших биологических макромолекул к активному, направленному на практическое применение полученных знаний. Появилась белковая инженерия - отрасль молекулярной биологии, задачей которой является усовершенствование природных белков для нужд человека и создание новых, не существующих в природе белков. Настоящая работа состоит из двух частей, отвечающих пассивному и активному этапу исследования белка. Первая часть посвящена изучению равновесных и кинетических промежуточных структурных состояний белка, позволившему нам выявить новое состояние белковой молекулы - состояние расплавленной глобулы, участвующее во многих биологически важных процессах. Вторая часть, включающая в себя практическое использование полученных знаний, связана с созданием новых белков с заданной структурой и свойствами.
Известно, что структура белка формируется под действием целого
ряда взаимодействий, имеющих разную физическую природу и отвечающих
различным уровням оргагоізаїти белковых молекул. Водородные связи
формируют вторігчпую структуру белка, гидрофобные силы способствуют
компактизащш белковой глобулы, электростатические, ван-дер-ваальсовы и
другие специфические взаимодействия определяют укладку боковых групп и
гонкие детали пространственной структуры. Эти силы по-разному зависят
от условий, в которых находится молекула белка, поэтому в определегагых
условиях возможно существование особых состояний белковой молекулы,
соответствующих ослаблению одних взаимодействий, в то время как другие
остаются неизменными или даже усиливаются. Такие состояния
реализуются в равновесии под действием умеренных денатурирующих
воздействий, а также в кинетике сворачивания белка из полностью
развернутой цепи, когда на разных этапах сворачивания "включаются"- и
"выключаются" различные физические взаимодействия, определяющие
структуру белка. Поиск и исследование подобных состояний важны для
выяснения основных законов структурной организации и
фуігкциоігирования белка, понимания процесса его самооргаїгизации и, в
конечном счете, для применения полученных знаний в белковой
инженерии. В то же время к моменту начала нашего . исследования в
литературе преобладала точка зрения, что белковые молекулы могут
находиться только в двух стабильных состояниях - нативном,
пространственно структурировагагом состоянии, отвечающем
функционально активному белку, и развернутом, близком к состоянию статистического клубка, без сугцественых элементов пространствеїшой структуры.
Конструирование новых белков с заданными свойствами является логическим продолжением исследования закономерностей формирования структуры и функции белка. Это не только лучший путь проверки уровня наших знаний о белке, но и практическое их использование с целью создания новых белковых конструкций с полезными свойствами. Первый
искусственный белок (или белок de novo) был создан 8 лет назад я с тех лор исследователи сконструировали несколько десятков искусственных белков. Структура большинства из них повторяла структуры природных белков. Наша работа посвящена получению искусствеїпіого белка с новой, не наблюдавшейся в природе структурой, а также введению в него функциональной активности и, таким образом, получению первого биологически активного искусственного белка.
Цель и задачи иследования Целью настоящей работы было: 1) поиск и исследование равновесных и кинетических промежуточных состояний белковых молекул, отличных по своим свойствам как от нативных, так и от полностью развернутых белков; 2) выяснение их роли в процессах, связанных с самоорганизацей и футжционированием белков; 3) моделирование промежуточных состояний и получение искусственных белков, которые по своим свойствам соответствуют подобным состояниям; 4) получение и исследование искусствешюго белка, сконструированного под заданную вторичную и пространственную структуру; 5) получение биологически активного искусственного белка.
На защиту выносятся следующие основные положения и результаты
-
Обнаружено и исследовано новое состояние белковых молекул -состояние расплавленной глобулы, промежуточное по своим свойствам между нативным и полностью развернутым состояниями белка.
-
Выявлены основные свойства состояния расплавлешюй глобулы и предложена его модель, согласно которой это состояние соответствует уменьшению ван-дер-ваалъсовых и других специфических взаимодействий, определяющих уникальную третичную структуру белка и размораживанию мелкомасштабных флуктуации структуры, в то время как водородные связи главной цепи и гидрофобные взаимодействия в молекуле белка в значительной степени сохранены.
-
Показано, что состояние расплавленной глобулы накапливается в процессе ренагурации белков, то есть является кинетическим промежуточным состоянием на пути сворачивания белка.
-
Получен искусствешгый белок альбебетин, сконструированный под задагагую пространственную структуру, не наблюдавшуюся до сих пор в Природных белках.
-
Показано, что альбебетин находится в состоянии, соответствующем состоянию расплавленной глобулы; он обладает близкой к заданной Вторичной структурой и компактной и относительно стабильной пространственной структурой, не противоречащей заданной.
6. Разработана эффективная система экспрессии искусственных
белков в E.coli с использованием техники слитных белков, позволившая
получить препаративные количества альбебетина и его модифицировагагых
вариантов.
7. На основе альбебетина получен первый искусствеїцшй белок,
обладающий задашюй биологической функцией, который сохраняет
основные структурные свойства альбебетина, имеет высокое сродство к
рецепторам на поверхности тимоцитов мыши и активирует реакцию бласт-
трансформации тимоцитов при коїщеіпрациях порядка 1011 М. "
Научная новизна Все перечисленные выше результаты получены впервые. Обнаружено и исследовано состояние расплавленной глобулы -новое состояние белковых молекул, промежуточное по своим свойствам между нативными и развернутыми белками. Это состояние впервые детально охарактеризовано с помощью целого ряда физических методов, несущих информацию о различных уровнях организации белковых структур. Впервые показана роль состояния расплавленной глобулы в процессе самоорганизации белка. Впервые получены и исследованы искусственные белки с новой, не наблюдаемой в природе архитектурой, также впервые предложено использовать их в качестве носителей отдельных биологических функций природных белков, на основании чего сконструїгрован и получен первый искусственный белок, обладающий биологической активностью.
Практическая ценность работы Полученные в работе результаты изменяют существующие представления о структуре белка, позволяют значительно приблизиться к пониманию процесса его самоорганизации, вплотную подойти к конструированию новых белков с полезными свойствами. Состояние расплавленной глобулы, впервые описанное нами на примере нескольких белков, в настоящее время обнаружено у многих белков и исследуется в целом ряде лабораторий. Широко обсуждается его роль в таких биологически важных процессах, как взаігмодействие вновь синтезируемых белков с шаперонами, транспорт белхов через мембрану, их взаимодействие с лигандами и др., поэтому понимаїше свойств состояния расплавленной глобулы важно для исследования назватгых процессов. Полученные автором результаты по конструированию и получению искусственных белков открывают возможность создания искусственных белков с заданной структурой и свойствами, которые могут быть использованы в качестве носителей различных биологических активностей, существенных для решения многих биотехнологических и медицинских задач.
Апробация работы Материалы работы докладывались и обсуждались на I Всесоюзном биофизическом съезде (Москва, 1982), XVI конференции FEBS (Москва, 1984), симпозиуме "Protein Folding, Structure and Function" (Keystone, USA, 1991), Международном симпозиуме "Biomolecular engineering and bioelectromcs" (Москва, 1991), Международной школе-семинаре "Modern problems of physical chemistry of macromolccules" (Пушино, 1991), I международном симпозігуме CAPE "Prediction and experiment. Three-dimensional structure of gomologous proteins" (Braunschweig, Germany, 1991), V конференции Российской Федерации "Новые направления биотехнологии" (Пушино, 1992), симпозиуме "Advances in gene technology: protein engineering and beyond" (Miami, USA, 1993), конференции Международного союза по белковой инженерии "INPEC-93" (Osaka, Japan, 1993), Международной конференции "Molecular genetics in modern biotechnology" (Mallorca, Spain, 1993), Международной конференции памяти академика АА.Баева (Москва, 1996) и других отечествешгых и международных конференцих.
Публикации Основные результаты работы отражены в 42 публикащіях, в том числе 20 статьях в отечественных и международных журналах.