Введение к работе
Актуїиіьиосгль работы. Гемоглобинопатии — аномальные гаюглобіиш (Hns) и талассемнчсские синдромы — являются гетеропнлюй группой наследственных-гаюлнтическнх аіісмнй человека, обуслсаташых нарушениями синтеза і-емоглобина її результате различных мутаций в oil, al, 8, G7, A7, 5 глобнновых генах. Они широко распрост)№іи во воеч мире, поэтому большое практическое значение имеет поиск простих, экспрессивных и относительно недорогах методов для молекулярной лиапіостики этих заболевании. В спсте этого, применение и оптимизация гопременного и щопхтеивного метода полимеразной цепной реакшш ЙШР) представляется крайне актуальной научной задачей для усовершенствования и ускорения идентификации аномальных Hbs к талассемических мутаций. При этом специфическая амплификация каааего в отдельности пена требует своей индивидуальной стратепш и нащивлешгого поиска конкретных экспериментальных условий ПЦР. Актуальность настояшей работы заключается в тем, что она является составной часті» системных исследований и разработки методологи:) диагностики гемоглобинопатии в рамках Международного Петра по диапюсгике паюглоСинолатий (Medical Collsge of Georgia [MCG],USA. піюфессор ТГЛХайаин) и лаборатории молекулярной организации хромосом (ИМБ РАН. академик АД'ЛнрззбексвІ
1'клью настоящей работы является совершенствование метода ПНР и его практическое применение дла молекулярной диапюстики наследегаегашх гемоглобинопатии человека, вызванных различного рода мутациями в шести глобнновых генах. Для достижения этой цели били посгавлеш следующие задачи: L Унификация стратегии и оптимизация экспериментальных условий ПЦР. 2. Выяснение волюжностей и преимущества использования ПЦР в молекулярной диагностике аномальных Hbs, идеггификацил jeerropux затруднена или недоступна традиционными методами белковой химии. 3. Использование ПЦР в качестве эффе:стианого и нерадиоактивного метода" идентификации делеционных мутаций в а и (3 глобнновых генах.
Научная новизна. В диссертационной работе (хізработана стратегия и оптимизированы, экспериментальные условия ПЦР для специфической амплификации фрагментов шести глоСиновых генов — о2, al, /3, G7, Ay, S. Лифферетинюваны мутации R дуплицированиих а геїах, которые принципиально невозможно установить методами белковой химии. В::српые экспериментально подтверждай более высокая частота нуклеотидиых мутаций по сравнению с аминокислотными заменами, тде показано, что одна и та же аминокислотная замена в а цепи 11в!' может быть вьпвана разными нуклеотидными мутациями в «2 или а! дуплииироганных генах. Оптимизированы условия
ПЦР и выбраны праймсроп для специфической амплнфикашш гибридных генов, образующихся при делешюнных мутациях и о и 0 глобиновых генах.
Научная и практическая значимость. Идентификацией более 100 точечных мутационных заме», ш них 10 новых аномальных Hbs, а также более 20 случаев делсиионных мутациий в а и 0 глобиновых генах, продемонстрировано, что использование ПЦР глобиновых гепов в сочетании с прямым сиквенированием значительно повысило эффективность диагностики гемоглобинопатии по сравнению с методами белковой химии за счет унификации и оптимизации процесса, сокращения временных и материальных затрат. С помощью ПЦР расширен спектр диагностики аномальных Hbs. идентификация которых затруднена или недосгушн классическими методами белковой химии. Решена новая научная и практическая задача в области совершенствования и интенсификации диапюстпки гемоглобинопатии с применением современных методов молекулярной биологии, что имеет значение для прикладной молекулярной биологии и в особенности для молекулярной медицины,
Лпробаиия работы. Материалы диссертации доложены на научных семинарах в MCG и ИМБ (1994-1
Нуб.шктиш работы. По материалам диссертационной работы опубликовано Ь печатных работ в журналах "Hemoglobin", "Am.J.of Hemat.", "Br.J.of Hemat.". Готовится к печати монография: "A Laboratory Manual for recombinant DNA identification of human abnormal hemoglobins " Marcel Dekker, Inc., N.Y., 1S94, 150 pages (T.P.Molchanova, D.D.Pobedimskaya, Yu.V.Postnikov, T.H.J.Huisman).
Объем и структура работы.. Диссертационная работа, изложена .-на 153 страниц машинописного текста, включающего 22 таблиц. 29 рисунков, список литературы из 125 наименований и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей методики эксперимента, изложения результатов исследования, их обсуждения, выводов, списка цитируемой литературы.