Введение к работе
Актуальность проблеми. Использование коротких олигокуіслеотіїдньїх проб для анализа нуклеотидной последовательности ДНК при помощи гибридизации находит повышенное применение для различных задач таких как: диагностика наследственных болезней и маркеров роста опухолей, типировакие генов гистосовместимости, молекулярная дактилоскопия, картирование генома, секвенирование ДНК и т.д. Каждая из этих задач требует проведения гибридизации исследуемой ДНК с большим набором олнгонуклеотидсв, что в свою очередь предусматривает усовершенствования существующих технологий, лучшего понимания, свойств нуклеиновых кислот и оптимизации процедур гибридизации, детекции и анализа гибридизационных сигналов. Значительные преимущества в цене и скорости аналитических тестов могут быть получены в результате миниатюризации диагностических инструментов. Использование микрочипов с набором ДНК-проб большой плотности представляется потенциальным решением этой проблемы.
Одним из основных препятствий использования метода гибридизации с короткими олигонуклеотиддмн для полного секвенмрования являются поеторы в исследуемой ДНК. Теоретически последовательности только 80% случайных фрагментов длиной 200 нт.может быть однозначно определена при гибридизации с матрицей, содержащей полный набор 8-меров [Khrapko el at, 1989]. Эффективность методз секвенирования гибридизацией может быть повышена методом дополнительной гибридизации встык (Дій) с пентамерами.
Цель работы. Целью настоящей работы является разработка методических подходов гибридизации-с олигонуклеотидной матрицей для анализа последовательности ДНК: разработка методов фрагментации длинной ДНК и дополнительной гибридизации встык (Дій) с пентамерами для диагностики и секвенирования.
Научная новизна работы. Разработана и оптимизирована методика псевдослучайной фрагментации ДНК реагентами Максама-Гилберта, позволяющая значительно повысить габридизационную эффективность длинных молекул ДНК. Детально исследована чувствительность метода дополнительной гибридизации встык с флуоресцентно-меченными пентамерами для выявления одиночных замен оснований в ДНК. Полученные данные позволяют дать количественную оценку преимуществ
данного подхода по сравнению с обычной гиоридшацией на матрице, а также подтверждают возможность использования ДГВ для секенирования ДНК. На примере мутаций Р-глобинового гена демонстрируется практическое применение метода гибридизации с олигонуклеотидной матрицей и ДГВ для задач медицинской диагностики.
Научно-практическое значение работы. Развитие новых методов и технологий
анализа последовательности ДНК является одним из ключевых направлений
Международной программы "Геном человека". Метод гибридизации нуклеиновых
кислот с олигонуклеотидной матрицей, представленный в данной работе
предусматривает значительное упрощение существующих технологий и снижение
цены аналитических тестов. ...
Разработана методология фрагментации ДНК, позволяющей успешно использовать короткие олигонуклеотиды для гибридизационных методов анализа ДНК. Работа демонстрирует возможность практического применения метода гибридизации с олигонуклеотидными микрочипами для медицинской диагностики на примере мутаций Р-талассемии. Использование ДГВ значительно расширяет возможности гибридизационных методов секвестрования ДНК и диагностики мутаций. Апробация работы. Результаты работы представлены на межденародных конференциях: Cold Spring Harbor Laboratory. May 11-15, 1994; DOE Human Genome Program Contractor-Grantee Workshop IV, Santa Fe, NM, Nov. 13-17, 1994; The CHI conference "Microfabrication Technology for Research andDiagnostics" Sep. 28-29, 1995 Структура u объем роботи. Диссертация изложена на 89 стр., включая 4 таблиц, 8 рисунков и состоит из разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты, обсуждение и выводы. Библиография включает 112 наименований. Основные результати получены автором самостоятельно.