Введение к работе
Актуальность проблемы. Диссертация посвящена вопросу развития полусинтеза, г'; одного из перспективных направлений белковой инженерии-и-решению с использованием полусинтетического подхода конкретных задач по выяснению структурно-функциональных особенностей строения кальцийсвязывающих белков. Работа завершает цикл доследований, посвященных выяснению структурно-функциональных особенностей строения кальцийсвязывающих белков, проводимых в ла-5оратории химии пептидов Института белка АН СССР. Эти исследова-{ия, начатые с проверки гипотезы о существовании общего эволюци-)нного предшественника кальцийсвязывающих белков получили даль-іейшее развитие в получении и изучении свойств полусинтетических >рагментов парвальбумина, содержащих один или два кальцийсвязы-;ающих домена.
Полусинтез фрагментов белков является одним из направлений елковой инженерии. Этот метод возник на основе сочетания и раз-ития методов пептидной химии и химии белка сравнительно недавно, оэтому неудивительно, что в диссертации уделяется большое вни-ание решению задач, принципиально важных для развития методоло-яи полусинтеза, прежде всего - определению границ применимости эдорастворимых активированных эфиров для получения полусинтета-зских фрагментов.
Цель и задачи работы. Цель настоящей работы заключалась в элучении фрагментов парвальбумина, содержащих замены аминокислот і N-конце и изучении их физико-химических характеристик длявыяс-!ния удельного вклада ионных и гидрофобных взаимодействий в фор-грование пространственной структуры кальцийсвязывающих белков. В ютветствии с этим были сформулированы следующие задачи:
Ї. Выделить в чистом виде парвальбумины из белых мышц щуки охарактеризовать их методом собственной флуоресценции.
-
Синтезировать пептиды участка 28-37 парвальбумина, подуть их активированные производные, а также активированные произ-дные различных аминокислот для последующей их конъюгации с при-цными фрагментами парвальбумина.
-
Выбрать подходящую защитную группу для модификации пар-льбуминапо є -аминогруппам остатков лизина, блокировать с по-дью выбранной защитной группы все остатки лизина. Убедиться,
э после деблокирования белок полностью восстанавливает свои зйства.
4. Расщепить модифицированный парвальбумин и выделить фраг-1ты 75-108 и 38-Ї08 парвальбумина, пригодные для полусинтеза,
т.е. имеюіцие свободную с<-аминогрушту и блокированные ь-аминогруппы.
5. Получить полуеинтетические фрагменты парвальбумина и сравнить их свойства с природными фрагментами парвальбумина и между собой в соответствии с поставленной целью.
Научная новизна и практическая ценность. Методом собственной флуоресценции охарактеризованы два ранее мало изученных парвальбумина - парвальбумын II и парвальбушн III щуки. Изучены кальцийсвязывающие свойства фрагментов парвальбумина Ш и их аце-тимидированных производных. Разработан метод, позволяющий присоединять к N-концу фрагментов парвальбумина производные аминокислот с помощью этого метода получены полусинтетические фрагменты парвальбумина, содержащие различные аминокислотные остатки на н-кон-цеj проведено сравнительное изучение полученных фрагментов. Синтезированы фрагменты участка 28-37 полипептидной цепи парвальбуьшна, получены их активированные производные и проведены экспери менты по присоединению синтетических пептидов к Н-концу фрагмент 38-108 парвальбумина.
Для химического синтеза пептидов предложен новый реагент -дипентафторфенилкарбонат, который внедряется в промышленное производство.
Публикации и апробации. Результаты работы докладывались на УІ Всесоюзном симпозиуме по химии белков и пептидов (Рига, 1983] на 16 конференции Федерации европейских биохимических обществ (Москва, 1984) и научных семинарах Института белка АН СССР. Основные результаты диссертации опубликованы в 8 печатных работах получено I авторское свидетельство на изобретение.
Объем и структура работы. Диссертация изложена на 283 стра ницах и состоит из введения, литературного обзора, теоретическо части, экспериментальной части и выводов. Работа содержит 8 таб лиц,'27 рисунков. Список литературы включает 235 наименований.