Введение к работе
/ Актуальность проблемы. Вирусный гепатит'Б" і'ГБ) является ол-ной из наиболее социально значимых инфекний, характеризующейся высоким ггоопентом неблагопоиятных исходов: хоонические заболева-ния печени, пирроз и гепатокарпинома. в результате острых и хронических форм инфекции. Более 300 млн. человек в мире находятся в состоянии хронического вирусоносительства и яеляются резервуаром инфекции. Поэтому разработка методов борьбы с этой инфекцией -одна из важнейших проблем здравоохранения. Поскольку эффективных этиологических средств лечения ГВ не существует, вакцинопрошилак-тика является наиболее эффективным способом контроля и предупреждения этого заболевания.
Разработка вакшшы против ГВ долгое время встречала большие
трудности в связи с узким кругом хозяев (человек и шимпанзе') и
безуспешностью культивирования вируса'in vitro. Использование ме
тодов генной инженерии позволило установить организацию генома
вируса гепатита Б і'БГВ) (Pasek.' 19791 и обеспечить возможность
лля разработки рекомбинантных субъепиничных и живых вакцин против
ГВ. -
Изучение иммунитета при ГВ показало, что протективными факторами иммунитета против БГВ являются гуморальный и клеточный иммунный ответ (TioIIais, 1985) на KBsAg и preS2 антиген оболочки.. HBeAg' и HBcAtf нуклеокапсила, что свидетельствовало о необходимости включения их в вакшшу против БГВ.
Одними из первых были получены рекрмбинантные штаммы вируса осповакпины i'BOB) (Paoietti, 1SS4; Smith, 1983) , зкспрессируюгие НЕзАг и вызывающие пои иммунизации лабораторных животных появление ачтп-лЗз-антител. Встссйка гена среднего белка оболочки БГВ в
ЕОБ С Cheng1, 19871 приводила к снижению уровня экспрессии HBsAg іл vitro, в тоже время не опубликованы ланные о иммуногенности полученного рекомоинантного BOB лля приматов.
Пели и задачи исследования. Настоящая работа посвяшена получению рекомбинантных БОВ, экспрессирукшшх гены БГВ: исследованию продукции белков, колируемых этими генами при инфицировании культуры клеток, а также изучению гуморального и клеточного иммунного ответов против антигенов БГВ при иммунизации лабораторных живот- . ных.
Основной целью работы является создание штаммов рекомбинант-ных БОВ, вызывающих при иммунизации животных индукцию иммунного ответа претив ВГБ и перспективных лля разработки живой рекомби-кантной вакпилы против ГВ.
Научная новизна и практическая ценность работы. Впервые получены рекомбинайтные BOB эффективно экспрессируюшие HBsAg с рге2-летерминантой, НБ-cAg и белок проявлявший антигенную активность ШеАг БГВ. Эффективная продукция HBsAij с рге52-детерминан-той была достигнута за счет изменения неблагоприятного для рибосом млекопитающих природного сайта инициации трансляции рге52-об-ласти на синтетический. Продукция ШсАг достигалась с гена С, тогда как экспрессия с AUG-колона ргеС-последовательности была неэффективной, удаление из гена С фрагмента t'117-ть 3'-конпевых н.п.), кодирующего полиаргининовый тракт белка нуклеокадсида, приводило к синтезу белкового продукта, который, не проявлял НВс-ан-тигенности но реагировал с антителами узнавшими зпитопы НВеАе.
Впервые показгно, что иммунизация приматов рекомбинантныы
штаммом BOB v7,5S2-S вызывает не только гуморальный но и клеточный иммунный ответ на HBsAcr с рге52-летерминантой. Иммунизация рекомбинантным штаммом v7.5C приводит к инлукшга гуморального и клеточного иммунного ответа на НБсАг у линейных мышей, а также гуморального ответа у обезьян.
Полученные рекомбинантные BOB v7,5S2-S и V7.5C, экспрессиру-юшие соответственно HBsAff с рге52-летерминантсй и НВсАв являются перспективными кандидатами для созлания живой рекомбинантной вакцины против ГВ.
Апробация работы. Материалы диссертации представлялись на конференции "Проблемы биотехнологии иммунобиологических и гемот-рансфузионных препаратов" (Новосибирск, 1988); Всесоюзной конференции "Генная и клеточная инженерия в решении фундаментальных проблем биотехнологии" (Тарту, 1988); Всесоюзном совещании (семинаре) "Молекулярная биология. ЛНК-содержащих вирусов, имеющих практическое значение для сельского хозяйства и медицины ('Киев, 1990); Всесоюзной школе-семинаре "Молекулярная биология и медицина" (Ленинград, 1990); V конференции Российской АН "Новые направления биотехнологии" (Пушино, 1992).
Публикации. По материалам диссертации опубліковано 5 научных работ. Получено 2 патента Российской Федерации и одно авторское свидетельство.
Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, литературного обзора - "Экспрессия чужеродных генов з составе генома ВОВ", материалов и методов исследования, описания результатов и их обсуждения, выводов и списка цитатуемой литераг/-