Введение к работе
Актуальность проблемы. Вирусный гепатит'Б (ГВ) является одной из наиболее социально значимых инфекций, характеризующейся высоким процентом неблагоприятных исходов: хронические заболевания печени, цирроз и гепатокарлинома, в результате острых и хронических форм инфекции. Более 300 млн. человек в мире находятся в состоянии хронического вирусоносительства и являются резервуаром инфекции. Поэтому разработка методов борьбы с этой инфекцией -олна из важнейших проблем здравоохранения. Поскольку эффективных этиологических средств лечения ГВ не существует, вакиинопрофилак-тика является наиболее эффективным способом контроля и предупреждения этого заболевания.
Разработка вакцины против ГВ долгое время встречала большие трудности в связи с узким кругом хсзяез (человек -и изйстанзе) и безуспешностью культивирования вируса' in vitro. Использование методов генной инженерии позволило установить организация генома вируса гепатита Б (БГВ) (Pasek.' 19791 и обеспечить возможность для разработки рекомбинантных субъединичных и живых вакцин против ГБ.
Изучение иммунитета при ГВ показало, что протективными Факторами иммунитета против БГВ являются гуморальный и клеточный иммунный ответ (Tioilais, 1985) на HBsAsr и preS2 антиген оболочки. НВеА? и НВсАе нуклеокапсила, что свидетельствовало о необходимости включения их в вакцину против ВГВ.
Одними из первых были получены рекомбинантные штаммы вируса осповагашны (BOB) (Paoietti, 1984: Smith, 1983) , экспрессирухете ЯЕзАг и Называющие пои иммунизации лабораторных животных появление asua-i-iBs-антител. Встройка гена среднего белка оболочки БГВ в
ECS iChenc, 1987j приводила к снижению уровня экспрессии HBsAg in vitro, в тоже время не опубликованы данные о иммуногенности полученного рекомбинантного BOB для приматов.
, леди и задачи исследования. Настоящая работа посвяшена получению рекомбинантных ВОВ. экспрессируюших гены БГВ; исследованию продукции белков, колируемых этими генами при инфицировании культуры клеток, а также изучению гуморального и клеточного иммунного зтветоЕ против антигенов БГВ при иммунизации лабораторных животных.
Основной целью работы является создание штаммов рекомбинантных ВОВ, вызывающих при иммунизации животных индукцию иммунного ответа против БГВ и перспективных для разработки живой рекомби-нантной вакцины против ГВ.
Научная новизна и практическая ценность работы. Впервые получены рекомбинантные ВОВ эффективно экспрессируюшие НВзАг с рге22-летерминантой. НБсАсг и белок проявляющий антигенную активность HBeAg- БГВ. Эффективная продукция HBsAg с рге52-детерминан-той была достигнута за счет изменения неблагоприятного для рибосом млекопитающих природного сайта инициации трансляции рге52-об-ласти .на синтетический. Продукти HBcAg достигалась с гена С. тогда как экспрессия с AuG-кодона preC-последовательности была неэффективной. Удаление из гена С фрагмента і'117-ть З'-концевых н.п.). кодирующего полиаргининовый тракт белка нуклеокапсида, приводило к синтезу белкового продукта, который не проявлял НВс-ан-тигенности но реагировал с антителами узнающими эпитопы HBeAg.
Впервые показано, что иммунизация приматов рекомбинантным
штаммом BOB V7.5S2-S вызывает не только гуморальный но и клеточный иммунный ответ на HBsAcr с рге32-детерминантой. Иммунизация рекомбинантным штаммом v7,5C приводит к индукции гуморального и клеточного иммунного ответа на НБсАе у линейных мышей, а также гуморального ответа у обезьян.
Полученные рекомбияантные BOB V7.5S2-S и V7.5C. зкспрессиру-юшие соответственно HBsAsr с рге52-летерминантсй и НВсАдг являются перспективными кандидатами лля создания живой рекомбинантной вак-пины против ГВ.
Апробация работы. Материалы диссертапии представлялись на конференции "Проблемы биотехнологии иммунобиологических и гемот-рансфузиошшх препаратов" (Новосибирск, 1988); Всесоюзной конференции "Генная и клеточная инженерия в решении фундаментальных проблем биотехнологии" (Тарту, 1988); Всесоюзном совещании (семинаре) "Молекулярная биология. ЯНК-содерлаших вирусов, имевших практическое значение для сельского хозяйства и медицины ('Киев, 1990); Всесоюзной школе-семинаре "молекулярная биология и медицина" (Ленинград, 1990); V конференции Российской АН "Новые набавления биотехнологии" (Пушино, 1992).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 научных работ. Получено 2 патента Российской Федерации и одно авторское свидетельство.
Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, литературного обзора - "Экспрессия чужеродных генов в составе генома БОВ", материалов и методов исследования, описания результатов я их обсуждения, выводов и списка шггиоуемой литерат"/-