Введение к работе
Актуальность проблемы. Узнавание тРНК соответствующей аминоацил—тРНК —синтетазой (ЛРСазой) — классический пример высо — коспецифичного белок — нуклеинового взаимодействия, часто встречающегося в живой клетке. Правильный выбор и аминоацилирование тРНК критически важны для воспроизведения генетически заданной первичной структуры белков. Известно, что АРСаза способна узнавать набор нуклеотидных остатков тРНК, так называемые "элементы специфичности". При определении этих элементов специфичности транскрипты различных генов тРІ 1К и их мутанты сравнивали со зрелыми тРНК той же специфичности по кинетическим параметрам аминоацилирования. Для многих АРСаз, в том числе для всех АРСаз из Е. coli и большинства АРСаз из дрожжей, были определены элементы специфичности, но, тем не менее, вопрос о структурных элементах, обеспечивающих специфичность аминоацилирования, до сих пор нельзя считать решенным.
Транскрипция in vitro с использованием РНК—полимераз бактериофагов SP6, ТЗ и Т7 была предложена в начале 1980 —х годов как эффективный метод синтеза биологически активных РНК. Разработка транскрипционных систем in vitro, позволяющих синтезировать любые РНК, привела к бурному развитию новых направлений исследований, в частности применительно к тРНК. В настоящее время транскрипты генов тРНК широко используют для изучения структуры и функции тРНК в различных биофизических и биохимических исследованиях. Относительная легкость получения разнообразных вариантов мутантних форм тРНК способствовала существенному прогрессу в исследовании механизмов взаимодействия тРНК с многочисленными белками трансляционного аппарата клетки. Однако, в ходе многочисленных исследований неоднократно отмечали, что транскрипты по сравнению с ДНК — матрицей часто удлинены на 3' —конце на один —два нуклеотида. Безусловно, присутствие удлиненных молекул в препаратах может значительно искажать исследуемые физические и биологические свойства транскриптов изучаемых генов. Таким образом, способность РНК — полимераз включать дополнительные нуклеотидные остатки на 3' — конец транскриптов создает определенные проблемы при синтезе и очистке нужного РНК — транскрипта. Несмотря на многочисленные попытки решить эту проблему
разнообразными методами, универсальный, надежный и достаточно дешевый способ до сих пор еще не найден.
Известно, что бактериофаг Т5 кодирует тРНК, специфичные ко всем аминокислотам, участвующим в белковом синтезе. Нуклеотидная последовательность генов всех этих тРНК установлена, и показано, что большинство из них имеет существенные отклонения от канонической структуры "клеверного листа" и низкий уровень структурного сходства с соответствующими изоакцепторными тРНК Б. coli. Поскольку фагоспецифичные тРНК и тРНК Е. coli функционируют в единой системе трансляции (в частности, аминоацилируются одними и теми же АРСазами), их с полным основанием можно считать природными изоакцепторами. По этой причине тРНК фага Т5 представляют собой уникальную модель для исследования различных сторон функционирования этих макромолекул, в том числе их способности узнаваться и аминоацилироваться АРСазами из Е. coli.
Цель и задачи исследования. Основной целью данной работы было изучение структурных особенностей тРНК, обеспечивающих специфичность аминоацилирования на модели тРЫК^фенилаланил — тРНК—синтетаза (PheRS). В качестве объекта исследования была выбрана синтезированная in vitro немодифицированная тРНК""5 фага Т5, В соответствии с данной целью конкретные задачи исследования состояли в следующем:
оптимизировать условия синтеза транскрипта гена тРНКр|ш фага Т5;
найти способ очистки транскрипта, позволяющий разделять продукты
нормальной длины и удлиненные на один — два нуклеотидных остатка;
— подобрать оптимальные условия аминоацилирования транскрипта гена
тРНКрь= фага Т5 PneRS из . соц.
— определить кинетические параметры реакции аминоацилирования
транскриптов гена фагоспецифичной TPHKph,> и его мутантов;
— сравнить кинетические параметры аминоацилирования транскриптов
генов тРНКРЬе фага Т5 с параметрами аналогичных транскриптов Е. coli;
— сделать выводы о расположении в тРНКРЬе "элементов специфичности"
для PheRS из Е. coli.
Научная новизна работы. В данной работе впервые проведено детальное изучение влияния удлиненных продуктов транскрипции in vitro
генов тРНК и димерных молекул тРНК на определение кинетических параметров аминоацилирования. Показано, что синтез удлиненных продуктов, а также способность к образованию димеров зависит от структуры тРНК. Разработаны методы очистки транскриптов генов тРНК, позволяющие получать гомогенные препараты данных транскриптов. Определены условия "активации" транскриптов генов тРНК, позволяющие избежать образования димерных молекул.
Впервые проведено изучение in vitro акцепторных свойств фагоспецифичной тРНКР1" в сравнении с изоакцепторной тРНКРЬе из Е. coli. Показано, что специфичность данного взаимодействия существеїшо зависит от ионных условий аминоацилирования (по концентрации Мд2+). Полученные данные позволяют предположить, что при физиологических ионных условиях (4 мМ Mg2+) PheRS узнает не только отдельные нуклеотидные остатки тРНК, но и конформацию отдельных участков молекулы тРНК. Результаты данной работы по определению элементов специфичности для PheRS Е. coli показывают необходимость пересмотреть некоторые выдвинутые ранее предположения о механизме взаимодействия тРНКгы с PheRS.
Научно-практическое значение работы. Предложенная в данной работе процедура очистки транскриптов генов тРНК позволяет получать практически гомогенные продукты транскрипции. Данный подход может быть успешно применен для получения, по крайней мере, всех бактериальных и фагоспецифичных немодифицированных тРНК. Кроме того, метод очистки электрофорезом в неденатурирующих условиях может быть использован при очистке достаточно коротких транскриптов любых других генов. Полученные результаты показали, что фагоспецифичные тРНК и транскрипты их генов могут служить удобной моделью для изучения разнообразных биохимических реакций с участием тРНК. Применение тРНК фага Т5 позволяет проводить сравнительный анализ физических и биологических свойств этих тРНК с соответствующими тРНК Е. coli, что особенно актуально для тех тРНК, которые не имеют изоакцепторов в бактериальной клетке.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на 16 Международном Рабочем Совещании по тРНК (16ш International tRNA Workshop, USA, 1995), на конкурсе научных работ ИБФМ РАН (Пущино,
1995), Городской научной конференции молодых ученых г.Пуїцино (1996), 17 Международном Рабочем Совещании по тРНК (17th International tRNA Workshop, Japan, 1997).
Публикации. По материалам работы опубликовано 5 статей и один мини —обзор.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания использованных материалов и методов, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Диссертация включает 106 страниц машинописного текста, 18 рисунков и 8 таблиц. Список литературы включает 145 источник.