Введение к работе
' Актуальность работы. Разработка методов введения чужеродной ДНК в геном высших растений послужила мощным импульсом для развития молекулярной биологии. Благодаря возможности переносить генетическую информацию, в руках исследователей оказались новые способы изучения структуры и функциональных особенностей генома растений. Трансгенные растения используют для изучения характера зкспрессии генов, роли регуляторних последовательностей, процессов рекомбинации. Сконструированы специальные векторы, позволяющие клонировать районы, окружающие участки встраивания чужеродной ДНК. Кроме того, методы генетической трансфорлации стали использоваться в биотехнологической практике для получения культурных растений, устойчивых к гербицидам, вирусам и насекомым.
Среда зекторов для трансформации растений наиболее широкое распространение получили векторы, сконструированные на основе природной системы переноса генов почвенной бактерии Agrobacteriun tuuer&clens. Введение в геном растения чужеродной ДНК с помощью A.tumefaclens не требует применения методов выделения и культивирования протопластов и сложных приборов, необходимых, например, для Езедзния ДНК с помощью электропорации или обстрела высокоскоростными микрочастицами. Т-ДНК, переносимая A.tumeTaclenz, mozbt быть использована, наряду с растительными транспозона.ми, для "маркирования" генов. В последние годы опубликован рад работ, в которых Т-ДНК использована для поиска в растительном геноме промоторов и последовательностей,
МОДУЛИРУЮЩИХ ЭКСПреССИЮ ГеНОВ (Kcncz et al, 1989; GoIdsborough and Bevan, 1990; Kertbundit et al, 1991; Topping et al. 1991).
В существующих векторных системах переносимый фрагмент ДКК содержит ген устойчивости к антибиотику, используемый для селекции транайор«фованных тканей в культуре. Но в ряде случаев сцепление селективного маркера с остальной частью введенной конструкции оказывается нежелательным. Так, для изучения последовательностей, окрукаюзих сайт инсерции перенесенного фрагмента ДНК (Т-ДНК), могут быть использованы репортерные гены. Однако, при использовании для селекции
трансформированных клеток маркера, сцепленного с репортерши геном, будут отобраны лишь те клетки, в которых окружающие растительные последовательности не препятствуют достаточной для преодоления селективного оарьера экспрессии маркера Т-ДНК. На наш взгляд, перенос в растительный геном фрагмента ДЕК, не содержащего селективного маркера, может Сыть осуществлен с помощью специальной векторной ситстема.
Поскольку система переноса ДНК A.tumeraciens способна переносить и встраивать в геном растения независимо две различных Т-ДЖ, селективный маркер может находиться на одной из Т-ДЖ, а остальная часть вводимой конструкции - на другой. Но для того,. чтобы вероятность появления трансформированных клеток, несущих обе Т-ДНК, была достаточно высокой, используемый штамм A.tuaeraciens должен обладать высокоэффективной системой переноса. Штамм А281 A.tume/aciens, несущий плазмиду рПВо542, способен с повышенной (по сравнению с другими штаммами) ' частотой вызывать быстро растущие опухоли у большого числа видов растений (Komari et ai, 19S6). Благодаря этим свойствам штамм А281 был назван "супервирулентным". Было показано, что супервирулэнтность связана с участком vlr-области рТ1Во542 (Jin et ai, 1987). Таким образом, на основе штамма А281 может быть сконструирована векторная система, способная к эффективному переносу в растительный геном двух несцепленных фрагментов ДНК. Возможность применения такой системы обусловлена ese и тем, что поиск трансформантов, несущих одновременно две Т-ДНК, одна из которых не содержит селективного маркера, может быть легко осуществлен с помощью метода полимерааной цепной реакции, получившего широкое распространение в последние годы.
Цель работы 1. Оценка эффективности трансформации хлопчатника штаммом A.tumefaclens А231 по сравнению с широко применяющимся шташом LBA4404. 2. Определение положения онкогенов 1 н бь TL-ДНК Ті-плазмидн Во542 штамма А281 относительно участков узнавания нёскбльких рестриктаз. з. Получение неонкогенного производного рТіВо5і2, в котором область Т-ДНК, содержащая онкогены, заменена на химерный ген устойчивости к гигромицину В. 4. Подтверждение способности
полученной неонкогеяной ті плазмиды к одновременному переносу в растительный геном двух несцепленных Т-ДНК.
Научная новизна и практическая ценность работы. Впервые показано, что штамм A.turns fас lens А281 вирулентен по отношению к хлопчатнику Gossyplum hirsutum, и при этом эффективность трансформации штаммом А281 выше, чем штаммом LBA4404. Получены новые данные о расположении генов 1 И 6Ь TL-ДНК относительно сайтов BamHi, Sail и Xbai. Сконструировано неонкогенное производное рТ1Во542, которое может Сыть использовано в качестве помощника в специальной векторной системе. Она отличается от существующих тем, что растительный селективный маркер устойчивости к тагромицину В и остальные переносимые гены находятся на несцепленных между собой Т-ДНК. Такая зекторная система может Оыть использована для поиска и изучения последовательностей растительного генома, контролирующих экспрессию генов. Кроме того, предлагаемая система может оказаться полезной в Оиотехнологической практике для получения трансгенных растений с минимальными, фрагментами чужеродной ДКК.
.Апробация работа. Материалы диссертации были представлены на Всесоюзной конференцин "Новые направления биотехнологии'', Пушю, 1990; на і Всесоюзном симпозиуме "Ноенє методы биотехнологии растений", Путино, J991; на семинаре отдела рекомОинантных ДНК Института молекулярной биологии РАН; на заседании коллоквиума центра "Биоинженерия" РАН.
Структура к объем диссертации. Диссертация состоит из
введення,, трех глэе, вызодое к списка литературы. Она
изложена 'на страницах, содержит рисунков и
Оиблиографзчесізій список ез названий.