Введение к работе
Актуальность проблемы. Цитомегаловирус человека (ЦМВ) является причиной многих тяжелых заболеваний, приводящих к серьезным последствиям и нередко к смерти: у новорожденных - вследствие вертикальной трансмиссии, инфицирования в постнатальный период (Демидова и др.,1976; Alt' ord et al..1981); v взрослых пациентов - в состоянии иммунной супрессии (у больных с синдромами иммунодефицита, после трансфузии, трансплантации органов) (.Чешик и др. ,1990; Но, 1991).
Широкое распространение ЦМВ среди населения, отсутствие типичных симптомов, частое течение цитомегаловирусной инфекции без клинических проявлений делают актуальной проблему быстрой специфичной диагностики цитомегалии.
Моноклинальные антитела (МКА), направленные к вирусным антигенам, обладающие высокой специфичностью и гомогенностью, оптимально подходят для выявления вирусных антигенов, а также являются экспериментальным инструментом при изучении структуры и функции вирусных белков. Наиболее эффективным иммунобиотехнологическим препаратом для лабораторной диагностики цитомегалии являются, по мнению исследователей, МКА к сверхранним белкам вируса, которые позволяют выявлять ЦМВ на самых ранних стадиях инфекции (Swenson and Kaplan,1985; Sinzger et al.,1983).
В нашей стране s настоящее время не выпускаются коммерческие антитела, позволяющие эффективно и с высокой чувствительностью выявлять антиген ЦМВ. В тоже время такие препараты необходимы для диагностики и мониторинга цитомегалии, так как широко используемые серологические тесты для определения специфических антител к ЦМВ не являются достаточными и эффективными для постановки диагноза (Stagno et al.,1984: Weber,1993).
Способность ЦМВ вызывать латентную и персистентную инфекции в организме человека (Rapp,19S3), возможная связь с онкогенными заболеваниями (Giraldo et al., 1980; Stevenson and Macnab, 1989), строгая видовая специфичность вызывают интерес к изучению взаимодействия вируса и клетки хозяина. Отсутствие адекватной модели ЦМВ-инфекции на экспериментальных животных затрудняет или делает невозможным изучение ЦМВ инфекции in vivo в настоящее время. В связи с этил важное значение приобретает анализ биохимических и биологических процессов, происходящих при различных формах ЦМВ инфекции, развивающихся в пермиссивных и не-пермиссивных клеточных культурах. Такие данные необходимы для понимания природы патогенеза ЦМВ инфекции человека.
Цель U задачи исследования. Целью настоящей работы являлось получение моноклональных антител (МКА) к сверхранним белкам цитомегаловируса человека (ЦМВ) и разработка на их основе методов детекции вирусных белков, а также сравнительное исследование действия ЦМВ на пермиссив-ные и непермиссивные клеточные культуры in vitro.
Для достижения этой цели ставились следующие задачи: 1.Получить гибридомные линии, стабильно продуцирующие МКА, направленные к белкам ЦМВ. ".Определить специфичность МКА в отношении белков, кодируемых сверхранними генами ЦМВ. 3.Изучить свойства МКА в различных иммунологических реакциях. 4.Установить возможность использования МКА для идентификации антигена ЦМВ после заражения клеток пермиссивной культуры клиническим материалом. 5.Провести сравнительный цитоморфологическии и иммуноцитохимический анализ действия ПМВ на пролиферацию пермиссивных и непермиссивных клеток.
Основные положения, выносимые на защиту.
1.Получены гибрвдомы, продуцирующие МКА, активно взаимодействующие с антигеном ПМВ в иммунохимических и иммунологических реакциях и специфичные к сверхраннему вирусному белку - 1Ер72.
2.Показана принципиальная возможность использования полученных МКА для выявления ЦМВ в инфицированных клетках.
3. Выявлены различия в действии ЦМВ на пролиферацию пермиссивных и непермиссивных клеток.
Научная новизна и практическая ценность.
[.Получены гибрвдомы, продуцирующие МКА, направленные к белкам ЦМВ. Установлена специфичность МКА в отношении сверхраннего белка 1Ер72 ЦМВ.
".Показана возможность использования полученных МКА для детекции антигена ЦМВ иммуноцитохимическими методами как в модельных клеточных системах, так и в инфицированных клетках человека.
3.Впервые, показано, что ЦМВ индуцирует нарушения хромосом, формирование К-митозов и остановку деления пермиссивных клеток при сохранении двухполюсного веретена деления. Это означает, что механизм формирования К-митозов под действием ЦМВ не связан с повреждением фибриллярного компонента аппарата деления.
Апробация диссертации. Материалы диссертационной работы были представлены на Международной европейской конференции по клинической вирусологии (Швеция. 1994г.), на Международной конференции по клеточной биологии (Германия. 1995г. і и на Пятой международной конференции по цитомегаловирусу (Швеция. 1995); фрагменты работы докладывались на ученом совете Института медицинской микробиологии и эпидемиологии Университета г.Лейпиига (Германия. 1994г. і. Б завершенном виде диссертационная работа прошла предварительную экспертизу на заседании отлела ''Молекулярная вирусология" НШ вирусологии и.м.Л.И.Ивановского РАМН 11 мая І995 года.
Публикация результатов исследования. Основные положения диссертации отражены в трех опубликованных научных работах, одна статья принята в печать и будет опубликована в 1996 году.
Структура и объем рабопы. Лисеерташюнная работа состоит ив введения, обзора литературы (4 глаЕЫ). описания материалов и методов, результатов собственных исследований 14 главы), обсуждения результатов, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 329 источников отечественных и зарубежных авторов. Работа изложена на 164 стоаницач машинописного текста, содержит 6 таблиц и 17 рисунков.