Введение к работе
улльность работы. Соматотропины (гормоны роста. ГР) представляют ion гормоны полипептидноп природы, синтезируемые передней долей юфиза. ГР состоят из 190-191 аминокислотного остатка 1а. о.) и ;ют молекулярную массу 22 кД. Сомгтотропины выполняет множество ікция в организме. Их оснозная Функция - стимуляция соматического :та. Кромэ того, ГР обладают диабетогенноя. инсуіаноподобноя, ібодической и другими активностями. В отличие от большинства ггих гормонов пептидной природы они видоспецифичнн.
Гормоны роста были одними из первых белков, полученных методами іетическій инженерии. Это было связано с необходимостью наработки югенных препаратов этих белков в значительных количествах как для широкого изучения, так и для применения в цедішчне и сельском іяястве. Так, использование ГР человека гает возможность іечивать карликовость, или гипофизарный нанизи. Введение ГР іьскохозяйствєнньш животным позволяет увеличивать привесы при юврекіеіїной экономии кормов,'а также повышает лактгнкю у коров, ічительньїя интерес представляет получение гормонов роста птиц. :кольку птицы обладают двумя лимфоидными орггнакя. тимусом и їрициевоя сумкой, продуцирующими соответственно Т-лимфоииты и жмфециты, они являются уникальными объектами для изугения влияния на иммунный статус (Marsn et al., 1984).
Цель и задачи исследования. Целью настоящего исследования іялось получение гормона роста кур (ГРК) методами гетерологичной :прессии в Е. coll, очистка и изучение сеоястз реетыбинантного >мона. В хога выполнения работы били поставлена и решены следующие
задачи: 1. Конструирование ялазмид, содержащих нуклеотидныи последовательности зрелого ГРК и его делеционных вариантов, находящихся вод контролем триптофановсго промотора и промотор? уридинфосформдазы Е. coll.,2. Создание ряда конструкция с различны» регуляторними элементами и сигнальными пептидами, предназначенны> для изучения секреции ГРКв с. соїї.З. Получение штаммов, содержащие полученные плазмиды, и выявление экспрессии генов гормона роста кур и его делеционных вариантов электрофоретическим и иммунологические методами. Подбор оптимальных условия индукции. 4. Очистка рекомбинантного гормона роста кур. Секвенирование N-концезоя части молекулы. 5. Тестирование рост-стимулируошея я лактогенноя активности полученного препарата.
Научная новизна и практическая ценность работы. Создан ряд экспрессирнних и секреторных конструкция, где экспрессия^ ГРК нахоаится под контролем различных регуляторних элементов. Получены штаммы . coll. обесг.ечивапшие достаточно высокий уровень экспрессии гормона роста кур (около 10 мг/л культуры, вышедшей на насыщение). Отработана методика очистки ГРК. Показано, что рекомбинантныя ГРК обладает биологической активностьп. Это дает возможность выделять гормон роста кур в препаративных количествах., достаточных для биологических испытания, что необходимо как для изучения гормональной регуляции у птиц, так и для возможного последующего применения в сельском хозяйстве. В ходе работы получены также штаммы, обеспечивающие значительные уровни экспрессии делеционных вариантов ГРК. Они могут быть использованы для изучения структурно-функциональных соотношения в ряду соматотропных гормонов. Кроме того, в связи с имеющимися данными о влиянии структуры
N-концевой области белков на их секрецир I Model et al., 1990), полученное делеиионные варианты могут быть использовали для изучения секреции гормонов роста в Е. coll.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены ка Всероссийской конференции "Новые направления биотехнологии", Пушино, 1992 у. на семинаре отдела генетической инженерии ИМБ РАК, г. Москва, 1СЭ4.
Структура работы. диссертация состоит из сведения, обзора литературы, посвяшенного гормонам роста позвоночных, животных, а также методам оптимизации экспрессии чужеродиьп; генов в бактериях Е. coll, экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов и списка литературы 1131 источник). Она изложена на 118 страницах, содержит 22 рисунка і: 3 таблицы.