Введение к работе
Актуальность проблемы. Создание трансгенных растений, гстойчивых к фитопатогенам, является в последние годы основной >бластью приложения сил генной инженерии культурных растений. )сновным направлением в этой области в настоящий момент является шэдение в них производных чужеродных гвное, которые обеспечивают яштез защитных белков в тканях растений и тем самым предохраняют а от губительного воздействия патогенных факторов. Очень юрспективными для использования в целях защиты растений от іаразитических . насекомых признаны гены параспоральных сристаллических белков почвенной бактерии ВасШиз thurlngtenata (О-эндотоксиков), обладающих высокоспецифичными инсектицидными :войстваш и являющихся безвредными для теплокровных нивотных.
Создание трансгенных растений, экспрессирующих бациллярные ^ены б-эядотоксинов, выявило практические трудности в детекции шсектотоксинов, синтезирующихся в трансгенных тканях в іезначительнкх количествах. Невысокий уровень экспрессии генов 5-эндотоксинов обусловлен их нехарактерным для растительных генов «данным составом и другими особенностями нуклеотидной юслэдовательности, что приводит к низкой эффективности процессов гранскрипции и трансляции. Тем не менее, в некоторых случаях экспрессия токсиновых генов под контролем сильных растительных-эегуляторных элементов обеспечивает достаточное количество белка цля придания трансгенным растениям устойчивости к поеданию дичинками чувствительных к данному токсину вредных насекомых. Настоящая работа посвящена создании производных гена О-эндотоксина ВасШиз thurlngtensts типа fturataftt HD-1 (токсичен для ?ешуекрылых), способных эффективно акспрессироваться в растениях, а также обеспечивающих маркерную активность токсичного продукта, что позволяет проводить отбор растений с наибольшим количеством ансектотоксина. .
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было, конструирование рекомбинвнтных кодирующих последовательностей на тонове гена О-эндотоксина ВагШиз xhuringienaia сгуІА(а) и маркерного гена nptll, обуславл ващего устойчивость ' к аминогликозиднш» антибиотикам, а также анализ экспрессии полученных гибридных генов в трансгенных растениях табака. Исходя из этого, оыли определены следующие задачи:
1. Конструирование рекомбинантных генов, сяабЕэншг
растительными регуляторними элементами, и кодирующих: а) токсичны
домен б-ендотоксина CRYIA(a); б) бифункциональный с5ало!
"токсин-ШЧІ".
-
Анализ функциональных активностей продуктов втих генов з Е. coll.
-
Анализ экспрессии гена бифункционального белка "токсин-НЕТ в трансгенных растениях табака.
4. Отбор растений с наибольшим уровнем синтеві
бифункционального белка и проверка их инсектицидной активности.
Научная новизна и практическая ценность работы. В хода настоящей работы получены трансгенные растения -табака, конститутивно синтезирующие гибридный деудомэнннй белоз "токсин-NPT", проявлящий инсектицидные свойства 3-андотокспн! Bacillus хшгітщіепаіа kuratakl HD-1 и обеспечиваиций способном! трансформантов расти в присутствии селективной концентрацш канамицина. Векторные конструкции с рекомоинантныма генами типі "инсектотоксин-nptll" могут быть использованы для созданш трансгенных растений различных сельскохозяйственных культур. Легк< тестируемая маркерная активность гибридного бифункционального белю позволяет отбирать трансгенные растения, аффективно вкспрессирупцш целевой ген, уже на стадии первичной регенерации. Возмозкності прямой канамициновой селекции на наличие токсичного белка позволяет контролировать сохранение внедренного гена в потомстве.
Апробация работы. Представленные в диссертации материалы был доложены її оОсувдены на 1-ом Всесоюзном и 11-ом Российски Симпозиумах "Ноше метода биотехнологии растений" (Пушино, 1991; 1993), а также на российско-германском совещании "Молекулярна! биология и генетика растений" (Москва, 1993).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, чотырех глав с описанием результатов и их обсуждения, выводов і списка цитируемой литературы из 218 наименований. Работа иакозкеш иь 136 страницах машинописного текста и проиллюстрирована И fисуяками и 3 таблицами.