Введение к работе
Актуальность проблемы. Стремительное развитие методов молекулярной биологии и генной инженерии существенным об; азом революционизировало изучение основ наследственности я открыло принципиально новые возможности прогресса в сельском хозяйстве, биотехнологической промышленности и медицине.
Баченим этапом в развитии биологических наук о человеке стало создание мевдународной программы "Геном человека",основной целью которой является определение нуклеотидной последовательности ДНК всего генома человека. Эти исследования а первую очередь направлена на изучение генов, мутации которых приводят к развитию тяжелых наследственных болезней, я имеют важное теоретическое и практическое значение для медицинской генетики в плане диагностики, профилактики и лечения наследственных болезней.
Муковисцидоз (MB), или кистозный фиброз поджелудочной железы, принадлежит к числу наиболее распространенных тяжелых наследственных болезней с ранней детской смертностью (Lowe С. et al.,I949). Высокая частота заболевания (1:2000-2500 новорожденных белой расы) , гетерогенность клинического проявления, а также почти полное отсутствие эффективного лечения обусловили, острую необходимость изучения молекулярной природы данного заболевания.
Успешное применение методов "обратной генетики" позволило в 1989 г. осуществить тонкое физическое картирование гена муковис-цидоза на хромосоме 7 в области q3l.I (Hommens J.п. et al.,I9a9)i клонирование его и расшифровку нуклеотидной последовательности (Hiordan J.R., 1989).Важным вкладом в изучение патогенеза муковис-цидоза стало открытие трехнуклеотидной делении в 10-м эк~оне гена, названной дг508, поскольку она приводит к утрате фенилалани-на в 508-м положении предполагаемого белка, названного трансмембранним регуляторним бачком муковисцидоза (ТРБМ.сгТй) (Keren в., et al., 1989). Дальнейшие исследования показали, что зо многих странах мира л я^оа ЯВЛяе"1С^ наиболее распространенной причиной развития заболевания, однако частота ее существенно варьирует в разных популяциях стран мира (Cystic fibrosis Genetic дпаїуеіа Consortium, 1990). На сегодняшний день открыто примерно 100 различных мутаций гена ТРБМ, но.остаются пока до конца не выясненными пути реализации структурних нарушений ДЖ в патологические фенотипы. Существенный вклад в- изучение этого вопроса должны влести
начавшиеся структурно-функциональные исследования ТРЕМ (Gregory н.J., 1990) .пошітки выделения и очистки данного белка (Gregoiy R.J., I99I),a также анализ характера мутаций гена ТРЕМ у больных разными клиническими формами муковисцидоза (Cutting G.u.et al., 1990; Detm ji. «t ai., 1990).Важны в отом плане также исследования по идентификации широкого спектра мутаций гена ТРЕМ и их распространения у больных из разных регионов земного шара.
Существенную роль в этих исследованиях играет анализ полиморфизма ДНК в локусах, тесно сцепленных с геном ТРЕМ, поскольку данные о неравновесии по сцеплению полиморфизма длины рестрикци-онннх фрагментов (ПДРФ) в этих локусах с геном ТРЕМ важны при поиске новых мутаций гена и для решения вопроса о времени происхождения мутаций и их распространении в популяциях разных стран (ївиі h.-С, 1989).Такие исследования важны так-также в практическом плане использования ІЩРФ как генетических маркеров для прелатальнои диагностики муковисцидоза.
Исследования ПДРФ-систем интересны также в аспекте популяци-онной генетики человека, в изучении варьирования нуклеотидных последовательностей ДНК его генома. По мнению Covalli-storaa L. (1990), исследования матшвдиввдуалъной изменчивости как нормального полиморфизма ДНК, так и мутаций, приводящих к развитию наследственной патологии, в популяциях человека должны неизменно дополнять анализ нуклеотадной последовательности ДНК, проведенный в рамках программы "Геном человека" на материале одного или двух индивидов.
Целью данной работы было изучение частоты встречаемости мутаций af50o, ssvjt". U55ID ?и R553X (в 10-м и Ы-м экзонах гена ТРЕМ) у больных различными клиническими формами муковисцидоза на Укгткне, и ассоциации этих мутаций с полиморфизмом ДНК в локусах ПК, I2P, D7S2J, D7So хромосомы 7, тесно сцепленных с геном ТЕШ, а также исследование полиморфизма ДНК'в вышеперечисленных локусах у населения региональных популяций Украины.
Б процессе выполнения работы решались следующие задачи:
-
Получение банка образцов ДНК из лейкоцитов периферической крови членов семей о высоким риском муковисцидоза из разных регионов Украины, а также здорового взрослого населения (доноров) Киева, Львова и Кременчуга (Полтавской обл.).
-
Проведение ДНК-анадиза мутаций дР50. (Ю-й экзон), 85^91,
G55I3 и ВД5^ {11-й экзон) гена ТРЕМ у де';ей, больных разными клиническими формами муковисцидоза, их родителей и здоровых сиб-
3. Проведение предварительных скринирующих исследований де-лецкл і?г,ои среди здорового взрослого населения некоторых регионов Укрины.
4.-Изучение характера ассициации ПДРФ-аллэлсй локусов МЕТ, D7Sd, IHP, D7S23 с мутациями гена ТРЕМ в семьях высокого риска муковисцидоза на Украине.
5. Изучение полиморфизма ДНК локусов D7S23, XRP и »7Sti в популяциях здорового взрослого населения городов Киева, Львова Кременчуга.
Научная новизна и практическая ценность работы. Создан банк из 169 образцов ДНК лейкоцитов периферической крови членов 60 со-мей с высоким риском муковисцидоза из разных регионов Укрзднн, а также из 365 образцов ДНК лейкоцитов периферической крови здоровых доноров Киева, Львова, Кременчуга.
Проведен ЕНК-ш'.ализ мутаций ^^Оо, S54-9I, G55ID я К553Х в 10-м и 11-м экзонах гена ТРЕМ у больных муковисцидозом на Украине. Показано, что делеция F^^ вносит существенный вклад в развитие тяжелых клинических ({юрм муковисцидоза на Украине.
Разработан модифицированный метод для одновременного ДНК-анализа делеции- ?с0в и некоторых мутаций в П-м экзоне гена ТРБЫ.
Проведены пилотные скринируодие исследования делеции Р50а у здорового взрослого населения разных регионов Украины. Показано, что ориентировочная частота гетерозиготных носителей этой глутащш на Украине составляет 1:40.
Показано неравновесие по сцеплению мутаций в гене ТРЕМ и ПДРФ-гаплоткпов Kg, С2 (локус D7S23) и Х^ (локус IRP). Показана равновероятная ассоциация мутаций в гене ТРН.1 с ПДРЗ-гаплотшіами ло-куса D7So (сайт узнавания для Pstl).
Проведен анализ изменчивости ПДРФ-генотапоэ локусов D7S23, інр и D7sa в региональных популяциях Украины. Полученные данные свидетельствуют о существенном вкладе полиморфизма ДІЖ в локуез D?sa3 (система сз.?-аіпб-і)в формировании генетической гетерогенности- данных региональных популяций Украины. Проведена оценка генетического сходства исследуемых популяций, основанная на анализе поламорфизма ДНК локусов D7S23, 1КР и D7So.
Результаты р=и<отн тлеют тр-з^чческов значение в плане даль-
іісЯшего изучения частоти и спектра структурних нарушений гена ТРЕМ и их роли в развитии разных клинических форм мук.овисаидоза на Украине. Анализ неравновесия по сцеплению полиморфных маркерных систем ДНК с муковисцидозом позволяет получить новые данные о возникновении и распространении мутаций в гене TPR1 на Украине, позволит вплотную подойти к пояску новых мажорных мутаций, ответственных за развитие муковасцидоза в семьях высокого риска данного заболевания на Украине.
Полученные результаты показали принципиальную возможность использования полиморфизма ДНК в локусах D7S25, ЖР и. с?йо в анализе генетической гетерогенности региональных популяций Украины и могут быть перспективны для анализа генетической структуры популяций.
Полученные данные имеют важное практическое значение для выбора эффективной стратегии пренатально!', диагностики и проведения скрининга мутаций гена ТРИ в семьях с высоким риском муковасцидоза на Украине. .
Данные о связи между наличием делении ?, t, у больных и развитием тяжелых форм муковисцидоза с недостаточностью функции поджелудочной железы позволят оптимизировать схемы лечения детей, больных муковисцидозом.
Апробация работы. Материалы диссертация докладывались на 1-й 2 симпозиумах по генной терапии (Киев, 1989,1990), I и 2 Всесоюзных конференциях "Геном человека" (Ііереславль-Залесский, 1990 .1991), Североамериканской конференции по муковисцидозу (Арлингтон, США, 1990).Европейской конференции по муковисцидозу (Копенгаген, I99IX
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 печатных работ.
Объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, полученных результатов, их обсуждения, выводов и списка литературы -195 источников. Работа изложена на 98 страницах машинописного текста, содержит 13 таблиц и II рисунков.