Введение к работе
I Л. Актуальность проблемы. Конструирование гибридных :ов, содержащих иммунологически компетентные эпитопы виру-человека с помощью белковой инженерии - перспективное нап-:ение биотехнологии для создания нового поколения эффектив-диагностических препаратов и вакцин.
За последние годы появились ряд публикаций, в которых по-ша перспективность использования нитчатых бактериофагов і М13 в качестве векторов для поверхностной презентации эк-шных полилептидов. В ближайшее время появится возможность 'чения на основе селекции с помощью фага М13 моноклональных ігел человека против вирусов человека и животных. Такая юлогия может заменить существующие сложные и трудоёмкие )ды, основанные на гибридомах.
В лаборатории молекулярной генетики Института вирусологии гктурные белки фага Т4 используются как модели для изучения шизмов белкового фолдинга. Кроме того на основе фага Т4 *ан вектор для экспонирования антигенных детерминант виру-человека (Ефимов,В.П. 1993).
Для развития работ по изучению фолдинга белков и белковой энерии целесообразно расширить спектр структурных белков а Т4.
В лаборатории молекулярной генетики впервые определена пеотидная последовательность генов 6-14, кодирующая струк-ные белки фага и созданы эффективные системы их экспрессии илипов.А.Г. 1992). Для изучения структурных и функциональ-свойств продуктов этих генов, а также гибридных молекул, данных на их основе, было необходимо разработать технологию паративного выделения высокоочищенных препаратов.
1.2. Цель я задачи работы. Основная цель работы состояла зучении физико-химических свойств структурных белков бакте-фага Т4, что является необходимым этапом для последующего ведения белковой инженерии. Для достижения этой цели нами и поставлены следующие задачи:
1. Разработать простой метод для препаративного выделения ельных структурных белков Фага Т4.
2. Изучить физико-химические свойства продуктов г<
9, 10, 11, 12 и WAC (фибритин) бактериофага Т4;
а) установить и уточнить молекулярные массы методами (
кового электрофореза в ПААГ с SDS и в неденатурирующих усл<
ях и равновесного центрифугирования; определить изоэлектрде
кие точки.
б) исследовать вторичную структуру перечисленных белке
молекул с применением метода спектрального анализа - кругоз
дихроизма, а также с помощью калориметрии изучить термодинг
ческие параметры денатурации и установить количество терме
намических доменов.
3. Разработать методы кристаллизации некоторых из изу^
ных белков фага Т4.
1.3. Научная новизна и практическая ценность работь
' В настоящей работе с применением адсорбционной хромат рафии разработан простой метод для препаративного выделени? очистки биологически активных рекомбинантных белков бактеї фага Т4.
Получены новые сведения фундаментального характера:
-
Методом кругового дихроизма изучена вторичная стру!< ра пг9,10,11 и WAC (фибритин).
-
С помощью калориметрии показано, что пг9 и пг11 и* не менее двух структурных доменов.
-
Впервые выращены кристаллы белка продукта гена 9, г годные для рентгеноструктурного анализа и получены наборы л ракционных данных с разрешением 2.8 А.
Результаты настоящей работы будут использованы для рас тия белковой инженерии, а также в исследованиях по белкоЕ фолдингу.
1.4.Основные положения, выносимые яа защиту:
1.Хроматография на гидроксилапатите позволяет препараї но выделять из экстракта клеток, инфицированных мутантом fl
белок фибритин, а также рекомбинантные белки пг9,10,11 и бактериофага Т4 с высокой степенью чистоты. 2.Белки пг9 и фибритин по своим физико-химическим свойс-наиболее подходящие для проведения работ по белковой ин-
рии. 3.Показана возможность получения кристаллов белка пг9
одных для построения трёхмерной структуры молекулы этого
а.
I.5.Структура и объём диссертации. Работа состоит из вве-я, обзора литературы, экспериментальной части, результатов едований и их обсуждения, еыводов и списка цитированной ратуры (136 наименований). Диссертация изложена на 113 яйцах машинописного текста, содержит 26 рисунков и 2 таб-
1.6.Апробация работы. Результаты исследований были предс-ены на всесоюзном симпозиуме по химии белков (Тбили-990), на международном симпозиуме "100 лет вирусологии" Петербург,1992) и на симпозиуме биофизического общества (США, 1993).
I.'/.Публикации. По теме диссертации опубликовано 4 печат-работы.