Введение к работе
Актуальность проблему:
В настоящее время для изучения взаимодействия негистоновых, ДНК-связывающих белков с различными регуляторными и структурными элементами ДНК на модельных и реконструированных системах используется широкий круг методов таких как футпринт, торможение в геле, транскрипция in vitro и другие. Несмотря- на значительные достижения в этой области, во многих случаях остается открытым вопрос о степени соответствия моделей, опирающихся только на эксперименты in vitro реально существующим в клетке структурам и механизмам. Подобные противоречия могут быть частично разрешены при помощи экспериментов іл vivo. Среди наиболее распространенных "следует отметить использование репортерных плазмид и минигенов, часто совместно с плазмидами, экспрессируюшими ДНК-связывающий белок, методы модификации ДНК in vivo, геномный футпринт и ДНК-белковые сшивки.
Применение ДНК-белковых сшивок имеет определенные преимущества перед другими методами изучения ДНК-белковых контактов in vivo, это практически единственный прямой метод, позволяющий ответить на вопрос: существует контакт (молекулярное взаимодействие) между данным белком и участком последовательности ДНК или нет? КФ-индуцированные сшивки ДНК-белок, широко, применяются в настоящее время, а их
использование в экспериментах in vivo удобно по ряду причин: незначительное время воздействия сшивающего агента на клетку, в течение которого не успевают активироватья защитные и репарационные системы, отсутствие прямого. химического воздействия, широким спектр ДНК-узнаюких белков, которые могут быть сшиты с ДНК.
УФ-индуцированные сшивки ДНК-белок in vivo проводились прежде на ограниченном числе объектов, наиболее распространенным из которых являлась бактерия E.col.i, некоторое число исследований было проделано на культуре клеток Drosopbila melanogaster. В настоящей работе бьша сделана попытка осуществить ДНК-белковые сшивки in vivd на дрожжах S.cerevisiae - простейшей модели при изучении процессов функционирования эукариотического генома. Нами был применен метод, позволяющий фиксировать ДНК-белковые взаимодействия -в -интактных ядрах, дрожжей при- помощи УФ-облучения. Детектирование сшитых ДНК-белковых комплексов осуществлялось при помощи "гибридизации с белковыми тенями" - метода, позволяющего исследовать комплексы на уровне конкретной нуклеотидной последовательности.
Цель работы:
Целью настоящего исследования была разработка ряда
методических рекомендаций, позволяющих осуществлять
УО-индуцированные сшивки негистоновых белков со
специфическими последовательностями ДНК в ядрах дрожжей, а также надежно детектировать свитые комплексы. Для проверки
воспроизводимости и надежности методики была выбрана простая модельная система, с известным расположением ДКК-связывающих белков. В качестве такой системы были выбраны рРНК гены, строение которых хорошо изучено, описаны специфические участки связывания для многих негистоновьа белков, в том числе хорошо известных. Детектирование ДНК-связывающих негистоновых белков дрожжей на различных последовательностях ДНК, в составе нетранскрибируемого спейсера рибосомальных генов дрожжей посредством УФ - индуцированных сшивок, явилось конкретной экспериментальной задачей работы.
Научная новизна:
Были подобраны конкретные экспериментальные условия ультрафиолетовой фиксации.ДНК-связывающих белков дрожжей на очищенных ядрах. На примере нетранскрибируемого спейсера рРНК' генов ' дрожжей было показано связывание негистоновых белков с различными функциональными участками спейсера: белок с молекулярным весом 120 кДа в области промотора 37S и экхансера, белок с молекулярным весом 30 кДа в области 37S промотора, белок с молекулярным весом 40 кДа в области инициации репликации. Сопоставление данных с литературой позволило предварительно идентифицировать некоторые белки: 120 кДа - REE1, 30 кДа - TFIID. Соответствие результатов, полученных методом УФ-сшивок данным о белковой организации нетранскрибируемого спейсера рибосомальных генов дрожжей,
демонстрирует адекватность разработанной методики.
"Ч
Апробация ед&пи:
Материалы диссертации докладывались . на 10-м
российско-германском симпозиуме "Структура и
функционирование генома" (Суздаль, 1993), а также на на конференции "Молекулярная биология на рубеже XXI зека." посвященной столетию со дня рождения В.А.Энгельгардта (Москва, 1994)
Публикации:
По материалам диссертации опубликованы четыре печатные работы. Список публикаций приведен в конце автореферата.
Структура работа:
Диссертация состоит из введения, трех глав (обзор литературы, материалы и методы, результаты и обсуждение), выводов, и списка цитированной литературы. Работа изложода на 90 страницах каашнописного текста, содержит 10 рисунков и 5 таблиц.
/