Введение к работе
Актуальность задачи. Дифференциальная генная экспрессия, реализуемая путем синтеза различных наборов мРНК, лежит в основе разнообразия фенотипов и функций живых организмов и в значительной мере определяет все жизненные процессы - развитие и дифференцировку, ответы на внешние воздействия, процессы гомеозиса, регуляцию клеточного цикла и даже запрограммированную клеточную смерть. Нормальное развитие, также как и патологические изменения, возникающие при различных заболеваниях, независимо от того, вызваны ли они одиночной мутацией или сложными мультигенными эффектами, сопровождаются изменением картины генной экспрессии. Сравнительный анализ генной экспрессии в различных типах клеток дает базисную информацию, опираясь на которую можно анализировать биологические процессы на молекулярном уровне.
Для идентификации и клонирования дифференциально экспрессирующихся генов в настоящее время широко применяются различные варианты дифференциального скрининга библиотек кДНК в сочетании, когда это необходимо, с вычитающей гибридизацией, а также фингерпринтирование клеточной популяции мРНК посредством ПЦР-амплификации с произвольными праймерами (дифференциальный дисплей мРНК). Одним из наиболее существенных недостатков этих методов является низкая чувствительность, что позволяет работать преимущественно с мРНК, имеющими относительно высокий уровень экспрессии - от нескольких сотен копий на клетку и выше. Однако, показано, что подавляющее большинство клеточных мРНК (около 96%) относится к классу редких последовательностей, число копий которых в клетке не превышает нескольких десятков. Предложенный недавно метод серийного анализа генной экспрессии, представляющий собой один из вариантов тотального секвенирования библиотек кДНК, теоретически обеспечивает возможность анализа редких мРНК, но его трудоемкость не позволяет надеятся на широкое применение в ближайшем будущем. Таким образом, разработка высокочувствительных методов анализа генной экспресии является актуальной задачей.
Цель работы. Целью исследования является разработка метода анализа генной экспрессии, позволяющего проводить идентификацию и клонирование дифференциально экспрессирующихся генов, в том числе с низким уровнем экспрессии.
Научная новизна и практическая ценность работы. В работе представлен новый метод анализа генной экспрессии, в основу которого положено рестрикционное картирование клеточной популяции кДНК высокого разрешения. В качестве основных стадий он включает получение репрезентативной популяции фрагментов кДНК, в которой каждому виду мРНК соответствует не более одного вида фрагментов кДНК, имеющих специфическую длину и последовательность, понижение сложности полученного набора фрагментов кДНК путем разбиения на менее сложные слабо-пересекающиеся поднаборы и анализ таких поднаборов при помощи высокоразрешающего электрофореза в денатурирующем полиакриламидном геле. Метод, таким образом, основан на визуализации фрагментов кДНК и позволяет "считывать" уровень генной экспрессии непосредственно с геля. Предлагаемый подход обеспечивает возможность прямого качественного и количественного сравнения спектров клеточных мРНК и детекции дифференциально экспрессируемых мРНК, что продемонстрировано на примере поиска генов, дифференциально экспрессирующихся в тимусе и селезенке мыши.
Метод может быть использован в молекулярной биологии и медицине для анализа экспрессии генов, диагностики и выявления механизмов патологий на генетическом уровне.
Структура и объем работы. Работа изложена на 98 страницах машинописного текста; включает введение, обзор литературы, результаты и их обсуждение, выводы и список цитируемой литературы (99 названий); содержит 18 рисунков и 4 таблицы.
Апробация работы. Материалы диссертации представлены на ежегодном конкурсе научных работ ИМБ РАН (Москва, 1995) в виде внеконкурсного сообщения и на международной Энгельгардтовской конференции (Москва, 1995).
Публикации. По материалам диссертации опубликованы 3 печатные работы.