Введение к работе
Актуальность проблемы
Клетки баиилл широко используются з качестве продуцентов ряда биологически активній веществ - ферментов, антибиотиков, гжно-істтслот. В последнее время на основе Bacillus subtilis был создан ряд продуцентов рибофлавина. Рибофлавин '(витамин В2) используется в составе ряда медицинских и кормовых препаратов, а также ъ пкгае-г-сй промышленности. Животные клетки не саособны синтезировать рибофлавин " долини получал» сто о ют;?»*. Незсст^.тс" рибофлавина в организме приводит к нарушению белкового обмена, замедлению роста. Рибофлавин относится к группе коферменткых витаминов и является предшественником флавинозых коферментов - флавинаденинмононуклео-тида (ФМН) и фдавинадениндануклеотида (ФАД), которые входят з состав многих окислительно-восстановительных ферментов-флавопроте-идов.
О/Еествукмие в настоящее время микробиологические способы получения рибофлавина основаны на использовании в качестве продуцентов дродней и дрогяпеподобных грибов Eremothecium asbyii и Ashbyii zossipi, синтезирующих до Б г/л рибофлавина за 160 часов культивирования, а такде бацилл. По сравнению с грибными продуцентами бациллярные обладают рядом преимуществ: они имеют более высокую скорость роста на простых питательных средах, синтезируемый клетками рибофлавин сэкрегкрузтсл в кулі>туральвую жидкость, что упрекает его выделение и очистку. Бациллы обладают мощным пентозным циклом, обеспечивающим высокий уровень накопления промежуточных метаболитов, те;.; самым синтез рибофлавина не лимитируется тіу.гом предшественников, з частности пуринов. Бактерии В. subtilis: относятся к микроорганизмам, генетический аппарат которых достаточно хорсто изучен, что поаволяет использовать для создания штаммов-продуцентов методы генетической инженерии. Кроме того, биосинтез рибофлавина у В. subtilis и его регуляция подробно изучались на протяжении многих лет как у нас в стране, так и за рубежом.
Результатом проводимой в течение ряда лет в ГосНШ генетики работы явилось создание серии рекомбинантных промышленных штаммов Bacillus subtilis и Bacillus amyloliquefaciens, способных накапливать в оптимальных условиях около 10 г/л рибофлавина за 60 часов культивирования. Сверхсинтез рибофлавина у этих штаммов обеспечи-
- 4 -вается присутствием рекомбинантной плазмады phiX45, имеющей в свое составе клонированный рибофлавиновый оперон В. subtilis. Однако плазмидные штаммы-продуценты как правило характеризуются рядом не достатков: нестабильностью при длительной ферментации; трудностям в подборе и обеспечении оптимальной дозы клонированных генов; ограничениями на использование плазмидных штаммов в промышленности. Основная цель настоящей работы заключались в разработке' новн подходов к конструированию рекомбинактных штаммов-продуцентов на основе В. subtilis, связанных с интеграцией в хромосому гетероло-гичных фрагментов ДНК, обеспечивающих сверхсинтез целевого продук та. В качестве модели была использована интеграция рибофлазиновог оперона В. amyloliquefaciens в хромосому "штамма В. subtilis - про дуцента рибофлавина. В задачи исследования входило
создание интегративных векторов, включающих клонированный дерепрессированный rib-оперон В. amyloliquefaciens;
введение rib-оперона В. amyloliquefaciens в хромосому модельного штамма В. subtilis путем встраивания гетерологичного фрагмента в триптофановый оперон;
введение rib-оперона В. amyloliquefaciens в случайным образом -выбранный локус хромосомы модельного штамма В. subtilis ("random integration");
создание штаммов В. subtilis - продуцентов рибофлавина с интегрированной копией rib-оперона В. amyloliquefaciens;
конструирование штаммов-продуцентов с дупликацией и амплификацией гіЬ-оперона В. amyloliquefaciens в хромосоме
В. subtilis;
- анализ стабильности и продуктивности полученных штаммов -
продуцентов рибофлавина.
Научная новизна и практическая ценность работы
Предложена альтернативная модель конструирования рекомби-нантных штаммов-продуцентов. Вместо' использования плазмидных зек-торов для введения в клетку необходимых генов модель предполагает интеграцию гетерологичных фрагментов ДНК, ответственных за биосин тез целевого продукта, 'непосредственно в хромосому-штамма-продуцента. ~
Сконструированы-интегративные векторы pES8, pACYC184-Rib-CmR и рЕК14 для введения дерепрессированного рибофлавинового оперона В. amyloliquefaciens в хромосому В. subtilis.
Рибсфлазкновый оперон В. amyloliquefaciens интегрирован в область триптофанового оперона хромосомы В. subtilis: как модель-вого штр«ма В. subtilis ribG850, так и иташа - продуцента рибофлавина Y25.
РибофлаЕикоЕкй оперон В. ащ/loliquefaciens интегрирован в случайный люкус хромосомы В. subtilis, использованная схема интеграции, в отличие от применяемых ранее, позволила избегать дополнительного этапа промежуточного клонирования гетерологичннх фрагментов ДНК в Е. coli. Отобраны стабильные варианты интеграции во Кгипбеллу. поау-іег бесгазямидный штамм-продуцент Y51, синтезирующий в три раза больсез количество рибофлавина, нетели штамм-реципиент.
, Сконструированы бесплазмидкые рекомбинантные штаммы-продуценты Y64-5 и Y64-20 с дупликацией и амплификацией гіЬ-оперона В. axtyloliquefaciens в хромосоме В. subtilis;
Проведен анализ стабильности и продуктивности полученных штаммов - продуцентов рибофлавина, который показал, что наибольшее количество рибофлавина синтезируют плазмидный штамм В.subtilis Y51/pMX45, имеющий в хромосоме дополнительную копию дєрепрессированного rib-оперена В. airryloliqusfaciens (около 5-7 г/л при культивировании в колбах и 14-15 г/л - з лабораторном ферментере) и бесплаамидный штамм В. subtilis Y64-20, "имеющий е хромосоме тандємную амплификацию дєрепрессированного rib-оперона В. anryloliquefaciens (около 8-9 г/л при культивировании в колбах). Достигнутый уровень продуктивности превышает уровень продуктивности плазмидных штаммов-продуцентов В. subtilis, применяе-дщх в настоящее время в промьншгенности для микробиологического, синтеза рибофлавина.
Структура и объем диссертации.