Введение к работе
В настоящее время происходит радикальный пересмотр представлений о механизмах элонгациии и терминации транскрипции.
Согласно классической модели во время элонгации молекула РНК-юлимеразы Е.coli закрывает -30 п.н. ДНК-матрицы, при этом 17-18 п.н. в ДНК эасплетены. Растущий конец РНК комплементарно спарен с матричной нитью ДНК, формируя протяженный РНК-ДНК гетеродуплекс, который определяет стабильность тройного комплекса. Исключая возможность конформационных чзменений в элонгационном комплексе, авторы классической модели считают, по присоеденение каждого последующего нуклеотида к З'-концу РНК сопровождается монотонным движением фермента по матоице. В рамках этой подели объясняется механизм факторнезависимой терминации. После ірохождения РНК-полимеразой специальной последовательности с центральной симметрией в РНК-продукте возникает вторичная структура -«шпилька», приводящая к разрушению части РНК-ДНК гибрида. Оставшаяся теть гибрида, содержащая З'-концевую олиго-и-последоватэльность в РНК, іегко плавится ввиду относительной нестабильности rU-dA -пар. Это приводит к высвобождению РНК-продукта из комплекса (Yager и von Hippel , 1987,1991).
Результаты исследований последних лет поставили под сомнение саждое из утверждений традиционной модели. Ключевыми стали работы , іемонстрирующие характерное изменение параметров тройного комплекса в іависимости от его положения на матрице. Открытие и изучение феномена ждорибонуклеазной активности тройного комплекса, данные РНК-азного рутпринта, а также подробное изучение свойств различных р-независимых ерминаторов указывают на то, что основную роль в удержании РНК в тройном сомплексе играет не протяженный РНК-ДНК гетеродуплекс, а белок-іуклеиновьіе взаимодействия (Chamberlin , 1994).
Разработка и применение новых экспериментальных систем, юзволяющих следить за конформационным состоянием молекулы РНК-юлимеразы во время элонгации и терминации транскрипции, дали бы возможность понять реальные механизмы, лежащие в основе этих процессов.
Цель работы и задачи исследования.
Целью работы являлось построение структурно-функциональной модели )лонгации и р-независимой терминации транскрипции РНК-полимеразы E.coli.
В работе ставились следующие задачи: 1) создать эффективную жепериментальную систему in vitro для выявления и подробного биохимического анализа интермедиатов элонгации и терминации
транскрипции. Для создания такой системы было необходимо : а) отработать метод «шагания», т.е. научиться получать серии гомогенных тройных комплексов на любом желаемом участке ДНК-матрицы, используя иммобилизованный на твёрдом носителе фермент РНК-полимеразы; б) сконструировать оптимальные ДНК-матрицы для выполнения реакции «шагания» . 2) с помощью методов РНК и ДНК футпринта охарактеризовать структурно-функциональные элементы молекулы РНК-полимеразы в разных элонгационных комплексах.
Научная новизна и практическая ценность работы.
Настоящая работа представляет собой систематизированный биохимический анализ структуры тройного комплекса РНК-полимеразы E.coli во время элонгации и терминации транскрипции.
На основе представленных в работе экспериментальных данных предложена модель, описывающая неравномерный характер движения молекулы РНК-полимеразы по ДНК-матрице. Согласно этой модели, во время элонгации, молекула фермента находится в двух альтернативных конформационных состояниях, напряжённом и релаксированном. Релаксированное состояние не обнаруживает несоответствий между поступательным движением по матрице и ростом РНК-продукта. Напряженное состояние возникает в ответ на специфические сигналы, закодированные в ДНК, и характеризуется временным прекращением движения молекулы фермента, в то время как синтез РНК продолжается. В результате создается гипотетическое напряжение, приводящее к прыжку передней границы молекулы РНК-полимеразы вперёд сразу на несколько нуклетидов и переходу в релаксированное состояние.
В работе также показано, что переход из напряжённого состояния в релаксированное есть неотъемлемый элемент действия р-независимых терминационных сигналов.
Предлагаемая модель элонгации является, по-видимому, универсальной для эукариотических и прокариотических РНК-полимераз. Возможно, что с её помощью удасться понять молекулярные механизмы регуляции транскрипции, основанные на взаимодействии с ферментом во время синтеза РНК.
Структура и объем работы,