Введение к работе
Актуальность проблемы. Изучение молекулярных механизмов адаптационно-трофического действия СНС, выдающегося открытия академика Л.АОрбели (Орбели Л., 1974), знаменует собой важнейший вклад в фундаментальные и прикладные аспекты современной молекулярной биологии, нейрохимии, нейрофизиологии, неврологии и основы высшей нервной деятельности в целом.
Известна важная роль верхнего шейного симпатического ганглия, как периферического неироэндокринного центра СНС (Cardinali D., et al., 1981, 1982) в регуляции обменных процессов в различных структурах головного мозга. Так, при ОГСЭ показаны нарушения углеводного и гликолипидного метаболизма (Мхеян Э., 1965; Буниатян Г., 1966), проницаемости мозговых мембран в отношении ФЛ и продуктов их превращений (Карагезян К., 1969, 1972; Овсепян Л., 1970), содержания общего белка и нуклеиновых кислот (Мхеян Э., 1974; Карапетян Т., 1976), изменения состава гистоновых и негистоновых белков (Мхеян Э., 1978; Кочарян К., 1981), физико-химических свойств хроматина, качественного и количественного состава его ФЛ и их жирных кислот (Овеян Г., 1989).
Результаты этих исследований свидетельствуют о возможном нарушении нейрогуморальной регуляции и антирадикальной защиты клеток, в частности, ссотношения про- и антиоксидантних систем крови при ОГСЭ. Особый интерес представляет изучение соответствующих параметров при сочетании ОГСЭ с ОАС, являющимся распространенным патологическим состоянием, характеризующимся многочисленными расстройствами гомеостаза внутренней среды организма на клеточном и организменном уровнях.
Состояние антиокислительной защиты клеток при указанных патологических состояниях изучено далеко недостаточно, в связи с чем актуальность предпринятого исследования обретает особый интерес и значение.
Целью и основными задачами исследования являлись изучение особенностей нарушений соотношения уровней анти- и прооксидантных систем крови, ФЛ состава СП и МЭ и интенсивности течения процессов СРО в крови белых крыс при ОГСЭ и ее сочетании с ОАС.
Для достижения поставленной цели были поставлены задачи по изучению при ОГСЭ и ее сочетании с ОАС:
- содержания ЦХ Ь$, b558(I)' ь558(її> «558(111). и b558(IV):
количества и особенностей сдвигов активности МП антиоксидантного действия - СОД, КТ, ЦП и ТФ;
количества и супероксидионгенерирующей активности СП;
качественного и количественного состава ФЛ СП;
качественного и количественного состава ФЛ МЭ;
- процессов ПОЛ, содержания ДК, МДА-модифицированных
белков и сс-ТФ в МЭ;
- процессов СРО и уровня ДК, МДА-модифицированных белков,
а-ТФ, ОХ и СМП в плазме крови.
Научпая повпзпа. Впервые показаны закономерности подавления и стимуляции активностей соответственно антиоксидантних и прооксидантных систем, возрастания количества водорастворимого NADPH-зависимого С>2" -продуцирующего ЛП - СП при одновременном падении его активности. Параллельно продемонстрирована роль ФЛ компонента СП в формировании нарушений его физико-химических свойств при ОГСЭ и ее сочетании с ОАС. Выявлена также специфика изменений качественного и количественного состава ФЛ МЭ и ее роль в повышении интенсивности течения процессов СРО как важного аргумента в патогенетическом комплексе изученных состояний.
Практическое значение работы определяется принципиально новыми данными в характере соотношения между анти- и прооксидантной системами, содержания ФЛ компонента СП как критерия прикладного профиля для понимания формы, глубины и специфичности сдвигов констатируемых при ОГСЭ и ОАС как в отдельно взятом виде, так и в сочетании. Этот показатель может оказаться полезным и в реализации принципов дифференциальной диагностики изученных нарушений от других патологических состояний, сопровождающихся также развитием оксидативного стресса.
Результаты проведенных исследований подтверждают
необходимость поддержания гомеостаза физиологического
балансирования двух контрсистем -про- и антиоксидантного действия,
как залог в сохранении компенсаторно-приспособительного потенциала в
необычных условиях существования организма. Проведенные
исследования еще раз подтверждают универсальность концепции
Л.А.Орбели об адаптационно-трофической роли СНС и ее
периферического звена - верхнего шейного симпатического ганглия в
поддержании структурно-функциональной целостности и
метаболической полноценности отдельных биологических систем клетки и организма в целом.
Основные положения диссертации, выносимые па защиту.
изучение изменений соотношения анти- и прооксидантных систем крови при ОГСЭ и ее сочетании с ОАС.
изучение активности антиоксидантных ферментов - СОД, КТ, ЦП и ТФ.
изменения содержания и супероксидионгенерирующей активности СП зависящей от качественного и количественного состава его ФЛ, интенсивности течения реакций СРО как самих ФЛ СП, так и липидов МЭ и плазмы крови.
- изменения интенсивности течения СРО в МЭ, содержания ДК,
МДА-модифицированных белков и а-ТФ.
- Изменения интенсивности течения процессов СРО в плазме, содержания ДК, МДА-модифицированных белков, ОХ и СМП как показателей глубины наблюдаемых расстройств.
Апробация работы. Основные результаты диссертации доложены и обсуждены на 1-ой Республиканской Конференции "Медико-биологические проблемы стресса" (1997), конференции, посвященной 30-летию со дня основания Института молекулярной биологии НАН РА (1998), X Международной конференции по химии органических и
элементорганических пероксидов (Москва, 1998). Апробация диссертационной работы состоялась на заседании Ученого совета Института молекулярной биологии НАН РА (1998).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 научных работ.
Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, описания результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа представлена на страницах русского компьютерного текста, иллюстрирована 5 таблицами и 3 диаграммами. Библиографический указатель включает 267 ссылок (198 русских и 69 иностранных источников).
Актуальности. проблемы. Изучение молекулярных механизмов внутриклеточной регуляции является одной из важнейших проблем современной молекулярной биологии. Внутриклеточггая регуляция, осуіцествляеліая с помощью эндогенных регуляторов — гормонов, сопровождается либо модификационными изменениями белков, ферментов, либо изменениями уровня их синтеза de novo. В совокупности такие изменения приводят к регуляции внутриклеточных обменных процессов в клетках-мишенях, сохранению в них нормального физиологического статуса.
В настоящее время принято считать, что гормоны, в зависимости от молекулярного механизма их воздействия на клетки-мишени, делятся на две группы. Первая группа гормонов (пептидные гормоны, катехоламины) передает клетке свою информацию путем, так называемого, мембрано-контактного типа циторецепции, связываясь с рецепторными белками, расположенными на клеточной поверхности. Такое высокоспецифическое связывание приводит к стимуляции трансмембранных универсальных механизмов, в результате чего гормональная информация передается во вігутрихлеточньїи метаболизм, посредством вторичных посредников (Розен, 1980, Cooper, Spraulding, 1985; Calvo et at 1996 и др). Функционирование в настоящее время хорошо известных этих механизмов (циклонуклеотидный и фосфоинозитидный) приводит к регуляции внутриклеточного метаболизма, главным образом, посредством модификации структуры белков, ферментов. Наряду с этим, гормоны второй группы (стероидные и тиреоидные гормоны), действуя на клетки-мишени посредством внутриклеточного типа циторецепции, регулируют метаболизм клетки, в основном, изменяя в них уровень биосинтетических процессов белков. Причем эти гормоны, будучи липофильными, сравнительно легко проникают в клетку, высокоаффинно связываются там с соответствующими рецепторными белками, образуя горлюн-рецепторные комплексы. Специфическое взаимодействие этих колшлексов с генетическим аппаратом клетки, в процессе которого рецепторы выступают как
акторы транскрипции, приводит к усилению синтеза белков de novo (Розен, 1980; rami et at, 1995; Yamamoto, 1995, 1996; Guiochon-Mantel et al, 1996; Beato et al, 1996; Jeyabmar et al 1997).
За последние два десятилетия в научной литературе появились данные, свидетельствующие о возможной взаимосвязи этих двух механизмов гормональной циторецепции. В частности, в ряде исследований показано, что стероидные гормоны способны также воздействовать на циклонуклеотидный и фосфоинозитидный пути регуляции (Бужурина, Панов, 1986; Brann et al 1995; Sadler et al, 1996), в то же время пептидные гормоны, в частности инсулин, способны интернализоваться в клетку и взаимодействовать с геномом (Dumonteil, 1996). В ряде работ показано, что рецепторы стероидных гормонов имеются также на поверхности мембран (Brann et al, Ї996; Sadler et al, 1996), то есть при взаимодействии гормонов с клетками-мишенями не исключается их воздействие на циклонуклеотидный или фосфоинозитидный механизмы. Ауриккио и сотр. (Migliaccio et al, 1984, 1986; Auricchio et al, 1985, 1987, 1996) выяснили, что активация внутриклеточных рецепторов эстрздиола, необходимая для их взаимодействия с гормоном, представляет собой процесс фосфорилирозания рецептора, который осуществляется протеи нкиназами, регулируемыми фосфоинозитидным механизмом. Вместе с тем, было показано, что на первичных этапах воздействия эстрадиол способен инициировать функционирование фосфоинозитидего регуляторного механизма, а действуя на уровне генома клеток, на раннем этапе воздействия и активируя биосинтетические процессы белков, привести к изменению физиологического статуса мембран, что может сказываться также на функциоііироваїдаи фосфоинозитидного механизма (Grove, Korach, 1987; Геворкян, Тадевосян 1990; Тадевосян, Геворкян, 1990; Brann et al 1995; Schulman et al, 1996).
Таким образом, несмотря на имеющиеся в литературе данные, в настоящее врелія изучеігие взаимозависимости мехашізмов мембрано-контактной
и внутриклеточной цитореуепций гормонов далеко не удовлетворительно. Исследования в этом направлении имеют большое значение как в аспекте дальнейшего изучения молекулярных механизмов действия гормонов, так и п отношении выяснения интимных гормональных механизмов внутриклеточной регуляции. Настоящая работа является частью исследований, посвященных этой проблеме.
Цель и задачи исследования. Основной целью диссертационной работы было изучение количественных изменений отдельных фракций фосфоинозитидов — как ключевых в функционировании фосфоинозитидного регуляторного механизма липидов, в некоторых мембранных и немембранных субклеточных структурах головного мозга крыс на первичном, раннем и позднем этапах in vivo воздействия эстрадиола.
В задачи работы входило:
1. Исследовать содержание общих фосфолипидов, а также их отдельных
фракций, в особенности, фосфоинозитидов в син^птосомах клеток головного мозга
крыс на разных этапах воздействия эстрадиола.
2. Изучить сдвиги в содержании фосфолипидов, в особенности,
фосфоинозитидов в препаратах ядерных мембран клеток головного мозга крыс на
разных этапах воздействия эстрадиола.
-
Изучить сдвиги в составе фосфолипидов и, в особенности, фосфоинозитидов ядерного матрикса клеток головного мозга крыс при активирующем геном воздействии эстрадиола.
-
Изучить сдвиги в содержании отдельных фракций фосфолипидов и, в особенности, фосфоинозитидов хроматина клеток головного мозга крыс при активирующем геном воздействии эстрадиола.
Научная новизна работы. В результате проведенных исследований
выяснено, что в синаптосомах и ядерных структурах (ядерная мембрана, ядерный
матрикс, хроматин) головного мозга крыс воздействие эстрадиола сопровождается
сдвигами содержания общих фосфолипидов и их отдельных фракции, что более
выражено на раннем этапе воздействия гормона. При этом показано повышение
общего содержания фосфолипидов и, в частности, фосфоинозитидов как на
первичном, так и на раннем этапах воздействия эстрадиола. Выявлена
разнонаправленность изменений фосфатидилхолина и сфингомиелина
внутриядерных структур клеток головного мозга крыс при in vivo воздействии
эстрадиола. Одновременно, установление, что при воздействии эстрадиола как в
мембранных (синаптосомы и ядерные мембраны), так и внутриядерных (ядерный
матрикс и хроматин) структурах происходит заметное перераспределение
содержания фосфоинозитидов, причем повышение содержания
монофосфоинозитида сопровождается уменьшением количества
трифосфоинозитида, т.е. наблюдается достоверное снижение соотношения трифосфоинозитид/монофосфоинозитид, что не может не иметь важное значение в функционировании фосфоинозитидного регуляторного механизма в мембранных субклеточных структурах.
Практическое значение работы. Изучение молекулярных механизмов действия эстрадиола на состав фосфолипидов и фосфоинозитидоз в некоторых субклеточных структурах головного мозга, несомненно, может иметь также практическое значение, в особенности, для выяснения некоторых задач клинической эндокринологии, в частности, гормонотерапии. Выявление возможных путей гормональной регуляции липидного обмена может оказаться весьма перспективным для лечения обменных метаболических заболеваний.
Аяробаыия диссертационной работы. Результаты работы
докладывались на: конференции "Биология старения", посвященной 50-летию основания ХГУ, Харьков, Украина, 1995; IX Международной конференции по вторичным посредникам и фосфопротеинам, Нешвилл, США, 1995; научной конференции, посвященной 30-летию основания отделения биофизики биологического факультета ЕГУ, Ереван, 1996; конференции, посвященной 30-летию основания института молекулярной биологии НАН РА, Ереван, 1997.
Публикации» По теме диссертации опубликовано 8 работ (3 статьи и 5 тезисов).
Объем и структура работы. Работа изложена на 125 страницах и содержит 14 таблиц и 12 рисунков. Библиография включает 258 наименований литературных источников, из них 25 на русском и 233 на иностранных языках.