Введение к работе
Актуальность темы. Данная работа посвящена изучению возможностей получения гибридом,синтезирующих моноклональные антитела (МКА) к миоглобину человека,эпитопному анализу миогло-бина и разработке метода иммуноферментного анализа миоглобина в сыворотке крови человека с помощью МКА.
Миоглобин как белок с хорошо изученной как первичной,так и пространственной структурой широко используется в качестве модельного белка для изучения многих фундаментальных проблем, в том числе реакций антиген-антитело. Миоглобин стал модельным объектом и для изучения антигенной структуры белка. Доказано существование на миоглобине кашалота двух типов антигенных детерминант или эпитопов: секвенциальных и топографических. Выявление у кашалота закономерностей антигенных свойств миоглобина вызывает вопрос об их специфичности и обшебиологи-ческом значении. В связи с этим представляет большой интерес молекулярно-иммунологическое исследование миоглобина и других животных, в том числе и человека. Тем более, что у человека такое исследование миоглобина имеет и чисто практическую ценность.
Являясь одним из основных белков скелетных и сердечных мышц и обладая небольшой молекулярной массой, миоглобин при патологических процессах легко проникает через поврежденные клеточные мембраны и попадает в обший кровоток, являясь отсюда полезным биохимическим маркером ряда заболеваний. Так, он служит одним из самых ранних маркеров некроза мышечных клеток, появляясь в крови раньше большинства ферментов и изофер-ментов, имеющих также диагностическую ценность. Ввиду этих причин в последние годы разработаны иммунологические методы определения содержания миоглобина в биологических жидкостях. Но все эти методы имеют ряд недостатков, которые усложняют их применение в клинической практике и производстве диагностику-мов для определения миоглобина.
Одним из путей преодоления этих трудностей является использование для создания диагностикумов моноклональных антител и иммуноферментного анализа. Это сочетание с большим успехом может быть использовано в разработке чувствительных ме-
тодов обнаружения и количественного измерения с клинической точки зрения важных веществ, в том числе и миоглобина.
Исходя из широкого использования гибридомной технологии в науке ясно, что именно МКА являются теми средствами, с помощью которых можно расширить наши знания об антигенных свойствах миоглобина у разных животных, а также решить вопрос о разработке оптимального иммунологического метода количественного определения миоглобина в сыворотке крови человека. Работа выполнена в рамках программы КПНТП СЭВ (задание 5.2.3.2.2).
Дель работы. Целью настоящей работы являлись:
получить при помощи гибридомной технологии стабильные клеточные линии, продуцирующие МКА к миоглобину человека;
изучить с помощью полученных МКА антигенную структуру миоглобина человека;
разработать на основе МКА чувствительный, простой и быстрый иммуноферментный метод количественного определения миоглобина в сыворотке крови с использованием микротитрационных пластинок.
Научная новизна:
получена панель моноклональных антител, связывающихся с б разными эпитопами молекулы миоглобина человека. Данные антитела направлены против двух секвенциальных и четырех топографических антигенных детерминантов (эпитопов);
получены МКА к секвенциальным эпитопам путем использования в качестве иммуногена нативного миоглобина;
обнаружен новый антигенный детерминант, в состав которого входят аминокислотные остатки 139-142;
на основе МКА разработан чувствительный и простой иммуноферментный метод одноэтапного "сэндвича" для количественного определения миоглобина.
.Практическое значение. Полученную панель МКА к разным эпитопам миоглобина можно использовать для изучения ряда важных фундаментальных научных проблем, в том числе для.изучения строения антигенных детерминантов и реакции антиген-антитело, для изучения закономерностей возникновения иммунного ответа, для изучения биохимической эволюции и конформацион-ных изменений миоглобина. МКА к миоглобину можно также использовать для изучения локализации миоглобина в разных тканях и клетках - проблема,которая еше довольно плохо изучена.
Для практической клинической медицины большую ценность имеет разработанный иммуноферментный метод количественного определения миоглобина. Метод может быть использован для выявления больных с различными сердечными, мышечными и гормональными расстройствами, для оценки тяжести заболевания и наблюдения за эффективностью лечения. МКА к миоглобину можно использовать для диагностики опухолей мышечного происхождения.
Структура работы. Диссертационная работа изложена на 90 стр. машинописного текста, включая 8 таблиц и 14 рисунков. Работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и их обсуждения, а также выводов и списка цитируемой литературы (136 источников).