Введение к работе
Актуальность проблемы. Б актуальной проблеме регуляции кле
точного цикла эукарист проблема инициации репликативного синтеза
традиционно привлекает внимание, ибо этой стадией детерминируется
дальнейшая редупликация генома. Основные трудности в изучении мо
лекулярных мехакизмоэ инициации репликации связаны с тем, что
структура предполагаемых ичасткоз инициации репликации априорно
гетерогенна. В этих услоНиях основным подходом необходимо приз
нать тот, который определяет_ отдельные элементы, необходимые для
акта первичного узнавания специфических нуклеотидных последова
тельностей, локализованных внутри участка инициации, специфичес
кими «верными факторами. Подобный принцип является общим для ряда
идентифицированных на сегодняшний момент предполагаемых участков
инициации репликации. Необходимо отметить,что относительно приро
ды таких взаимодействий, а также характеристики' нуклеотидных
структур и белковых факторов,обуславливающих подобное взаимодейс
твие, в литературе существуют только отдельные сообщения. Так,в
работах Тимченко с соавт. [117] из альфа-полимеразного комплекса
нерегенирнрующих гепатоцнтов крыс была изолирована и проклониро-
ваяа последовательность ДНК, названная DARC1, которая в контексте
прокариотического вектора обеспечизала автономную репликацию ре-
комбинантнсй конструкции в культивируемых клетках млекопитающих.
Подобное свойство нуклеотидного фрагмента DARC1 позволило отнести
описываемую последовательность к предполагаемому участку инициа
ции репликации млекопитающих и предполагать,что все или почти все
сигналы для функциональной активации данного фрагмента ДНК лока
лизованы на изучаемой нукпеотидной последовательности.
Цель' работы. Целью данного исследования было: идентифициро вать отдельные функционально-значимые нуклеотидные последовательности (цис-элементы) в последовательности DARC1 и изучить природі) ядерных факторов (транс-элементов), взаимодействующих с ними. Проанализировать степень подобия идентифицированных цис-транс элементов и характер цис-транс взаимодействие с механизмами цис-транс активации в строго идентифицированных участках инициа-
пни хромосомной репликации млекопитающих.
Для этого необходимо было решить следующие задачи.
-
Минимизировать размер последовательности DARC1 с тем, чтобы в состав производного уіастка вошли все элементы, обеспечивающие автономную репликацию рекомбинантного прокариотического вектора в клетках млекопитающих.
-
Возможно подробно охарактеризовать пептиды ядерного экс тракта, взаимодействующие с данной минимизированной последова тельностью: установить возможную аналогию с другими уже известны ми пептидами, определить их молекулярный вес, внутриядерную лока лизацию и степень выраженности их функции в клеточном цихле.
-
Определить структуру специфических аффинных сайтов в пре делах изучаемой последовательности и степень их вырожденности.
-
Определить наличие в структуре изучаемой нуклеотидной пос ледовательности неканонических форм ДНК (изгибы, шпилечные "крестообразные" структуры ДНК) и установить возможность их внут риклеточной стабилизации.
-
Экспериментально подтвердить наличие аналогичных цис-тран элементов в структуре хорошо изученного хромосомного участка ини циации репликации в составе дегидрофолатредуктазного домена клетках млекопитающих.
-
Провести компьютерный анализ на предмет возможной кластер ной локализации подобных аффинных сайтов в регуляторных областя раэ~ичиызс генов млекопитающих (не менее 10 строго полностью сик ванироваикых и имеющих строго идентифицированные регуляторные зс ны) .
Научная новизна полученных результатов:
Впервые установлено, что фрагмент ДНК размером в І46п.н. дос таточен для автономной репликации рекомбинантного прокариотичес кого вектора в клетках млекопитающих; впервые выявлены два пепт* да из ядерного экстракта специфически взаимодействующих с предпс лагаемым участком инициации автономной репликации: один из низ совпадающий по молекулярному весу и структуре аффинных сайтов с-туе белком в тесте с антителами как не с-тус белок и отличаете конститутивным уровней экспрессии в клеточном цикле-, а другой б( лок (р28), ранее не идентифицированный в других иссі'.-яования.)
:трого локализован в ядерном матриксе; приведены эксперимента)!!. ШЄ доказательства тому, что аффинный сайт Oct-І белка обладает ааметной вырожденостью; впервые идентифицирован новый аффинным ;айт в протектируемой ядерными белками зоне на последовательности 1ARC146; впервые доказано, что "крестообразные" структур. , теоретически представленные из анализа нуклеотиднои последовательности і зоне инвертированного повтора, могут существовать в плаэмидном сонтексте внутриклеточно; впервые выявлена почти полная аналогия основных цис-транс элементов предполагаемого УИР DARC146 и*хромо-:омного УИР дегидрофолатредуктазного домена млекопитающих; вперше определен кластерный характер локализации 7 асЬфинных сайтов, характерных для УИР, в структуре регуляторних областей 10 генов млекопитающих, резко отличающихся друг от друга по "числу и лротя-кенности экзонов и колирующих областей.
Практическая значимость работы. Результаты данкых неследова чий научно обосновывают создание векторных систем, включающих ак гивный промотор, для получения конструкций обеспечивающих высокий уровень экспрессии клонированных генов в клетках эукарнот; с использованием антител к идентифицированным неканоническим структурам ДНК представляется перспективным хромосомное картирование активных участков генома;примененная в работе программа компьютер кого анализа первичных последовательностей генов, позволяет проводить идентификацию регуляторных областей; модернизирована и адаптирована программа двухнитевых участков ДНК на предмет обнаружения изгибов ДНК.
Апробация работы. отпепьные фрагменты диссертационной работы многократно докладывались на научных семинарах ОМРБ ПИЯФ, РАН, и институте молекулярной генетики РАН (1992)6 в институте бноорга-ническон химии РАН (1993), в институте канцерогенеза онкологического научного центра РАМН (1993), а также на международных симпозиумах и конференциях: Второй международной конференции регуляции эукариотической репликации ДНК, Монреаль, Канада, 1992,- Международной конференции по эукариотической репликации, Колл Спринт Карбор, США, 1993; Третьей международной конференции по регуляции эукариотической репликации ДНК, Монреаль, Канацч, 1994; истомной конференции по геном-у человека, .ериоголонка, Россия, 19 4.1.. и
1995 голу работе присвоена вторая прения 8 конкурсе лучших работ ПИЯФ РАН.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 13 работ.
Структура и объем диссертации. Работа изложена на 124 страницах мапинсписнсго текста, состоит из введения, четырех глав и приложения; содержит 24 рисунка. Список литературы включает названия, из которых на русском языке .