Введение к работе
Актуальность темы. Химозины являются .неонвтальными желудочными протеазами и относятся к группе аспартатных протеаз, которая включает также пепсины А и С, ренин, катепсины D и Є из протеаз млекопитающих, многие энзимы грибков и протеаэы ретровирусов. Аспвртатными протеазами выполняется широкий спектр физиологических функций, начиная от регуляции.давления крови и кончая процессами метаболизма клеточных белков, они отличаются друг от друга по области воздействия (экстрацеллюлярные, лиэоэомальные) и по субстратной специфичности С от высокой специфичности ренина до способности пепсина расщепить "почти всё") . Ряд обстоятельств (идентичные аминокислотные остатки активного центра и одинаковая пространственная структура энзимов, а особенно - консервативная организация ген'ав этих протеаз) указывают на то, что гены различных аспартатных протеаз млекопитающих возникли от общего предка путем дивергенции. Для получения более детальной картины об эволюции семейства генов аспартатных протеаз млеколитаюмих требуются сравнительные данные о структуре генов аспартатных протеаз.
Химозины отличаются от других желудочных протеаз (пепсины А и С) более высокой субстратной специфичностью: они расщепляют молочный белок к-каэеин, вызывая свертывание молока, но в меньшей мере, чем пепсины, повреждают иммуноглобулины, содержащиеся в молоке. Предполагается, что высокая уровень экспрессии гена прохимоэина (ПХ) и низкая уровень экспрессии генов пелсиногенов на неонвтвльной сталим развития способствуют образованию приобретенного иммунитете новорожденного.
Наиболее подробно изученным представителем химозинов является химозин быка. Отметим лишь, что определены его первичная и пространственная структуры, клонированы ген (до настоящей работы единственный из генов ПХ) и кДНК ПХ в ряде лабораториях мира. Клонирование и экспрессирование кДНК ПХ быка в гетерологических системах открывает возможность подступить к белковой инженерии химозина, а также может представлять биотехнологический интерес.
Цель работы. Целью настоящей работы является молекулярное клонирование и структурный анализ кДНК ПХ быка, экспрессирование кДНК ПХ быка в Escherichia coli, клонирование и изучение структуры гена ПХ человека.
Нвучная новизна работы. Впервые клонирован участок генома человека, гомологичный зкэонам и фланкирующим последовательностям гена ПХ быка. Установлены размер, рестрикционная карта и частичная первичная структура этого участка. Установлено, что нуклеотидая последовательность наблюдаемого гена человека, соответствующая кодирующему региону гене ПХ быка, содержит изменения по сравнению с кодирующем регионом гена ПХ быка, которые исключают возможность кодирования полнорвзмерного белка, гомологичного ПХ быка. На основании этих данных сделан вывод, что в геноме человека содержится псевдоген ПХ.
В первичной структуре кДНК ПХ быка, клонированной в настоящей работе, выявлены ряд замен основании по сравнению с ранее опубликованными нуклеотидными последовательностями кДНК ПХ быка.
Практическая ценность работы. Клонированная в настоящей работе кДНК ПХ быка применима для экспрессирования в гетерологических системах. Изготовленные плаэмиды, обеспечивающие экспрессию кДНК ПХ быка и ее делеционных мутантов в Escherichia coll, могут быть использованы для продукции рекомбинантного ПХ и его Фрагментов.
Структура работы. Диссертация изложена на 121 стр. машинописного текста, включая 3 таблиц и 26 рисунков. Работа содержит следующие разделы: введение, обзор литературы С посвящен сруктуре генов аспартатных протеаз млекопитающих, экспрессии генов прохимоэина и филогенетическим отношениям генов желудочных аспартатных протеаз позвоночных), материалы и методы, результаты и обсуждение, выводы и список цитируемой литературы (186 источников).