Введение к работе
Актуальності» проблемы. В последнее иремя в биотехнологии широко применяют генно-инжеперные иггаммы-иродуцеиты биологически активных соединений, в том числе аминокислот и ферментов. Конструирование генно-инженерных штаммов-продуцентов іребует фундаменальных знаний о метаболизме микроорганизмов и молекулярной оріа-пизацни соответствующих генов. Важным глранюм сунерактивности конструируемых штаммов является также правильный выбор штаммов. С этой точки зрения термостабнль-Ш)сп> бакісрин B.stcarothcrmophilus является существенным технологическим преимуществом. Между тем успешное использование его ограничено вследствие малой изученности этого объекта. В частности к началу настоящей работы не было данных по молеку-ляршы-епетическому исследованию генов биосинтеза аргинина у B.stcarothcrmophilus. В литературе приводились данные о том, что у Bacillaceac биосинтез аргишша осуществляется по "линейному" нуги и ключевую стадию биосинтеза, как и у E.coli, выполняет первый фермеїгг бносшггетического ггути-К-ацетшнлугаматсшггетаза. Одішко.благодаря детальным исследованиям нам удалось выяснить, что для B.stcarothcrmophilus, а также двух других видов Bacillus, характерно трапсацетилирование N-ацетилорнитина с возвращением ацетильной группы с помощью орнитипанегилтрансферазы обратно на глутамат. Тшателыюе изучение клонированных генов и кодируемых ими ферментов биосинтеза аргинина B.stcarothcrmophilus позволило показать, что первый фермент- орнитинацетил-трансфераза ипгнбируется, но не аргинином, а орнитином и в отличие от других видов, осуществляющих "циклический" путь биосинтеза, М-ацетш1глутамат-5-фосфотрансфераза не ипгнбируется конечным продуктом биосинтеза. К началу настоящей работы отсутствовали также какие-либо сведения о характеристике фермента аминоацилазы B.Mcurolhcrmophilus, об организации и регуляции гена аминоацилазы, и об экспрессии бациллярного гена в гстсрологичпом цитоплазматическом окружении кишечной палочки. Вместе с тем фермент амипоацилаза широко используется в производстве аминокислот для разделения сгереоизомеров, полученных химическим синтезом. Конструирование штамма, продуцирующего чужеродную термостабшп.иую аминоацилазу B.stcarothcrmophilus в мезофилыюм хозяине, очень выгодно с биотсхнолотческой точки зрения т.к. значительно облегчается задача выделения и очистки фсрмсігга. Поэтому представлялось актуальным нгучип. организацию и рсіуляцию гена аминоацилазы B.stcarothcrmophilus и охарактеризовать этот фермент.
Цель и задачи нсследопаиия. Цан.ю раГиш.1 является изучение молекулярной организации генов бносшггеза аргинина и і сна аминоацилазы термофильной бактерии
B.stcarolhcrmophilus и использование полученных результатов дня конструирования высокоактивных іитаммов-продуцеитов. В соответствии с этим были поставлены следующие задачи:
-структурный и функциональный анализ рекомбннантной плазмиды, содержащей argJB гены биосинтеза аргинина B.stcarolhcrmophilus; -изучение экспрессии argJB генов B.stcarotlicrmopliilus в клетках E.coli. -определение и анализ нуклсотншіой последовательности выделенных генов, -характеристика ферментов - продуктов клопнропанных генов биосинтеза артшнша B.stcarolhcrmophilus.
-молекулярное клонирование гена амипоанилазы B.stcarothcrmophilus. -структурный и функциональный анализ рскомбннаїгпюй илазмилы, несущей ген аминоашшазы.
-определение и анализ иуклеотидиой последовательности гена амипоанилазы. -характеристика фермента амимоацилаза.
Научная новизна и практическая значимость работы. Определены полные (гуклеотидные последовательности argJ и argB генов биосинтеза арпшииа термофильной бактерии B.stcarothcrmophilus и проведен детальный компьютерный анализ последовательностей. Показано, что они образуют кластер с другими генами биосинтеза аргинина, располагаясь па хромосоме B.stcarothcrmophilus в порядке argC-J-B-D. Установлеио.что биосинтез арпшииа у B.stcarothcrmophilus осуществляется "циклическим" путем и продуктом гена argJ является ингибируемая орнитином бифункциональная орнитинацетилтрансфераза. Установлеио.что продукт ієна argB - г^-ацстилглутамат-5-фосфотрансфераза термофильной бактерии B.stcarothcrmophilus, синтезированная о клетках мезофильной бактерии E.coli, проявляет свойственную ей термостабилыгую природу и аналогично ферменту E.coli не подвержена ингибированню аршинном.
Осуществлено молекулярное клонирование гена амипоанилазы термофильной бактерии B.stcarothcrmophilus. Показано, чго не смотря на способность комшісмсіпнро-вать мутацию в гене argE E.coli, ген амипоашишзы B.stcarothcrmophilus не имеет супіо-шсЕїия к биосиїггсзу арікшша и в отличие от N-ацспщортгпшдеацетилазы E.coli расщепляет широкий спектр N-ацстшшроизподнмх L-амнпокиаіот, в том числе и аромаїнчсскнх. Показано, чго аминоакилаза обладает термостабильной природой, что намного обломает се очистку из экстракгов мезофильной бактерии. Определена полная иуклеотидная ностсловатслыюстъ гена амипоанилазы и нровслен легальный компьютерный анализ лоп последовательности.
Ocnomn.ic положения, выносимые на защиту: -Ген argJ B.stcarothcrmophilus кодирует синтез термостабилыюй, бифункциональной орннтипацешлтрансферазы, шіпібнруемой орнитином.
-Ген argB кодирует синтез термостабилыюй, не ингибируемой конечным продуктом биосинтетического пути, Ы-ацет1шглугамат-5-фосфатрансферазы. -Определена полная иуклеотшиая последовательность 3,4 тип EcoRI- фрагмсігта ДНК B.slcarollicrmophilus, несущего гены argJ и argB. -Выделен ген амнпоанилазы B.stcarothcrmophilus.
-Фсрмсігг аминоацилаза B.stcarothcrmophilus обладает термостабилыюй природой и широкой субстратной специфичносгъю.
-Определена пуклеотидиая носледоватсльпость гена аминоацилазы. -Транскрипция гетеролопічпьіх генов argJ, argB и ama в клетках E.coli осуществляется с собственных промоторов. -Осуществлена очистка и охарактеризован фермент аминоацилаза.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, методической часга, экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов и списка цитируемой литературы. Обзор литературы состоит из двух глав, касаюпшхся анализа данных об организации н регуляции і сноп биосинтеза аргинина и гена аммиоицшшзы у прокариотов и эукариотов. Экспериме/ггалымя часть состоит из трех глав, которые посвящены исследованию генов биосиїггеза аргинина н гена аминоацилазы термофилыюй бактерии B.stcarothermophiIus.Pa6crra изложена на 116 стр. машинописного текста, включая 7 таблиц и 20 рисунков. Библиография включает 177 наименований.