Введение к работе
Аістуальность темы. Современный уровень знаний, накопленный в результате
исследования структурных свойств белков, дает возможность перейти к их активному практическому применению. Конструирование искусственных белков или белков de novo позволяет значительно расширить и пополнить имеющиеся знания о закономерностях структурной организации белковых молекул, связи структуры белка и функции. Первый белок de novo, полученный в 1988 г. в группе ДеГрадо (Regan & DeGrado, 1988), отметил собой начало быстрого развития нового направления в молекулярной биологии - белковой инженерии искусственных белков. В этом направлении уже достигнуты значительные успехи (обзоры Hecht, 1996; Долгих и др., 1996), однако сконструированные к настоящему времени искусственные белки, все еще уступают по стабильности и компактности природным белкам и находятся в состоянии, называемом состоянием расплавленной глобулы (Ptitsyn, 1995).
Полученный ранее в нашей лаборатории искусственный белок альбебетин (Долгих и др., 1991; Fedorov et.al., 1991) обладает пространственной структурой типа aPfSafSf} (две а-спирали, лежащие на /Элисте). Топология этого белка уникальна и не наблюдалась в природных белках (рис.1), хотя и не противоречит никаким известным законам формирования белковых структур. Исследования альбебетина с помощью различных физико-химических методов показали, что он обладает компактной и относительно стабильной структурой, похожей на первоначально заданную (Fedorov et.al., 1991; Chemiris et.al., 1994), но находится скорее в состоянии расплавленной глобулы, чем в состоянии соответствующем нативному состоянию природных белков. Можно предложить несколько возможных объяснений отсутствия у данного искусственного белка жесткой пространственной структуры:
-
противоречие топологии альбебетина каким-либо еще не известным законам формирования белковых структур, приводящая к тому, что нативный белок с такой топологией невозможно получить вообще;
-
отсутствие заданного пути сворачивания белка или, другими словами, центра сворачивания;
-
неплотная упаковка боковых аминокислотных групп внутри молекулы, возникающая в силу каких-либо неточностей дизайна;
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было анализ топологии, предложенной для альбебетина, и выяснение причин, ведущих к формированию у него состояния расплавленной глобулы. Исходя из целей работы, были сформулированы следующие задачи:
1) Выяснить принципиальную возможность получения сконструированной топологии:
а) найти природный белок с жесткой третичной структурой, имеющий сходное с
альбебетином расположение элементов вторичной структуры в пространстве и
клонировать его ген;
б) придать ему топологию альбебетина путем мутации;
в) разработать эффективную систему экспрессии и очистки изучаемых белков;
г) изучить и сравнить физико-химических свойства природного и мутантного
белков и альбебетина;
2) Исследовать влияние на структуру альбебетина введения фрагмента 131-138
интерферона ct2 человека на N-концевую последовательность белка;
Научная новизна и практическая ценность работы. Клонирован ген рибосомального белка S6 из Thermits thermophilus. Проведен теоретический дизайн и получен циркулярно пермутированный вариант белка S6. Получены бактериальные штаммы, продуцирующие в больших количествах природные и мутантные белки (до
50 мг/л). Разработана схема очистки рибосомального белка S6 и пермутантного варианта рибосомального белка S6. Проведено сравнительное исследование термостабильности, спектров кругового дихроизма и ядерного магнитного резонанса рибосомального белка S6, пермутантного варианта рибосомального белка S6, и модифицированного альбебетина и их равновесной денатурации в присутствии мочевины. Установлена возможность реализации новой топологии в пермутанте. Показано, что при гибридном синтезе процесс сворачивания пермутированного S6 осложнен связью с мальтозосвязывающим белком и/или отсутствием метионина в первом положении, что ведет к лабильности третичной структуры у белка.
Полученные результаты открывают возможность создания новых искусственных белков с заданной структурой и свойствами, которые могут быть применены для решения актуальных биотехнологических и медицинских задач.
Апробация работы. Материалы работы докладывались на следующих российских и международных конференциях: Втором съезде биохимического общества российской академии наук (Москва, 1997); II открытой городской научной конференции молодых ученых города Пущино (Пушино, Московская область, 1997); Конференции, посвященной 30-летию журнала "Молекулярная биология" (Москва, 1997); Международном симпозиуме "Структура белков, стабильность, фолдинг. фундаментальные и медицинские аспекты" (Москва, 1998).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано восемь печатных работ, в том числе 4 статьи в отечественных и международных журналах.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 103 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и обсуждения, выводов и списка литературы, содержит 2 таблицы и 19 рисунков.