Введение к работе
Актуальность проблемы. Важность всесторошего изучения протеолитических ферментов определяется тоіі ролью, которую 01Ш играют в регуляции разнообразных процессов внутриклеточного метаболизма. Однако, в силу многих причин о протеазах растений известно сейчас значительно меньше, чем о протеолитических ферментах нивотннх и бактерий. В то же время, получение протеолитических ферментов растений в высокоочищенном виде, знание их свойств и выяснение их физиологических функции имеют большое значение для понимания механизмов синтеза белка в растениях, транспорта белков, механизмов запасания и утилизации белков при прорастании семян и т.д.
Одним из ключевых процессов метаболизма.растений является протеолиз запасных белков при прорастании семян. Имеющиеся сейчас данные указывают на то, что основную роль в этом процессе (главным образом, у бобовых) играют цистеиновые протеиназы,
Синтезируемые de novo при ПрОраСТаНИИ СемЯН ( Shutov and
vaintraub, 1987). В РЭДв случаев соответствующие цистеиновые протеиназы были выделены из семян в высокоочищешюм виде и подробно охарактеризованы (Щутов а др., 1976, 1978; Baumgartner,
Chrlapeels, 1977).
Вместе с тем, в последнее время в литературе появились отдельные указания на присутствие в покоящихся семенах некоторых растений металлопротеиназ, такге способных участвовать в гидролизе ЗапаСНЫХ беЛКОВ (Нага, Matsubara, I98Q; БеЛОЗеРСКПЙ И Др.,
1983, Bond, Bowies, 1983). Однако, сведения об этих протеича-зах немнбгочисленны, в высокоочлщеннюл виде они не выделялись, отсутствуют данные о механизме регуляции их активности.
Цель и- задачи исследования. Целью' настоящей работы было изучение мэталлопротеиназы покоящихся семян гречихи и ее роли в протеолизе главного запасного белка семян гречихи - I3S глобулина при прорастании.
В соответствии с этим были поставлены и репались следующие экспериментальные задачи:
-
Выделение в Еысокоочищенном состоянии препарата метал-лопротеиназы из покоящихся, семян гречихи.
-
Изучение физико-химических свойств, природы активного центра, субстратное специфичности выделенное ыеталлопротенназы.
-
Изучение внутриклеточной локализации и возможных меха-
- z -
низмов регуляции активности металлопротеиназы при прорастании семян гречихи.
Научная новизна и практическая ценность. Впервые из высших растений (семена гречихи) получен гомогенный препарат ме-таллопротеиназн, изучены его физико-химические свойства, природа функциональных групп активного центра, субстратная специфичность и сделано заключение о возможной физиологическол роли.
Показано, что ыеталлопротеиназа осуществляет ограниченный протеолиз главного запасного белка семян гречихи - I3S глобулина на первой стадии деградации этого белка при прорастании семян.
Из покоящихся семян гречихи получен высокоочищенный препарат ингибитора металлопротеиназы, изучены его свойства,.изменение активности при прорастании.
Установлено, что, как ыеталлопротеиназа, так и ингибитор этого фермента локализованы преимущественно в белковых телах -внутриклеточных органеллах, служащих местом отлогения главного запасного белка - I3S глобулина.
Проведенные исследования позволили сделать заключение о том, что в покоящихся семенах гречихи существует регуляторная система "протеиназа - ингибитор - субстрат", контролирующая начальный этап протеолиза главного запасного белка семян гречихи - 13 S глобулина при прорастании семян.
Разработанные методы препаративного выделения металлопротеиназы и ингибитора семян гречихи могут быть использованы для получения аналогичных белков из других растительных объектов.
Выводы диссертационной работы о существовании в семенах гречихи регуляторяой системы "протеиназа - ингибитор - субстрат" имеют значение для общего понимания механизмов метаболизма белков и регуляции активности ферментов у растений.
Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на 16-ой конференции Федерации европейских биохимических обществ (Москва, 1984), на 18-ой конференции молодых ученых Биологического факультета МГУ (Москва, 1987) и на научной конференции молодых ученых Межфакультетской проблемной научно-исследовательское лабораторій им. А.Н.Белозерского, посвященной 70-летию Октября" (Москва, 1987).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 2 печатные работы.
Структура и объем работы. Диссертация излоаена на 154 страницах машинописного текста, содержит ЗО рисунков, 1f таблиц и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитированной литературы (268 наименование, из них 60 на русском языке).
Список использованных сокращений