Введение к работе
Актуальность проблемы.
Точное узнавание белками специфических последовательностей ДНК - это предпосылка точной регуляции транскрипции. Молекулярная основа такого узнавания составляет одну из важнейших проблем молекулярной биологии. Белок 1ас-рспрсссор - парадигма ДНК-узнающих белков. Он узнает и прочно связывает свою специфическую операторную последовательность в геноме E.coli и препятствует транскрипции генов метаболизма лактозы. Сродство 1ас-рспрессора к своему оператору модулируется связыванием с белком индуктора, например, изопропилтиогалактопиранозида (IPTG). Присоединение IPTG к репрессору уменьшает константу его связывания с оператором с 10 М* до 10 М" , но не влияет на связывание рспрсссора с неспецифическими последовательностями ДНК с константой связывания 107 М"1. Итак, индуктор способен "выключать" 1ас-репрессор, делая его неспособным узнавать свой оператор, но не влияя на нсспсцифическое взаимодействие репрессора с ДНК. В результате рспрессор, связавшийся с индуктором, выключается и перестает блокировать транскрипцию. Механизм действия индуктора неизвестен. Поскольку репрессор может взаимодействовать с одной и той же - операторной - ДНК и специфически и, в присутствии индуктора, неспецифически, он является удобным объектом для исследования проблемы ДНК-белкового узнавания.
N-концевой фрагмент Іас-рспрессора, содержащий остатки 1-51/59, образует структурный домен, способный связывать ДНК. Модель трехмерной структуры ДНК-связываюшей части lac-репрессора установлена при ЯМР-исследованиях этого домена. Эта структура содержит мотив "ос-спираль - поворот - ос-спираль", открытый ранее при исследовании других белков. Однако, ориентация этого домена относительно оператора противоположна ориентации, установленной для всех закристаллизованных белков, например, для Х-сго - белка.
ІГель работы.
Мы исследовали эту особенность lac-penpcccopa, а также способ его выключения индуктором. Для этого методом ковалентных ДНК - белковых сшивок
была изучена структура комплексов репрессора со своим оператором в присутствии и в отсутствие индуктора и комплексы репрессора с неспецифическими последовательностями ДНК. Образование сшивки некоторой аминокислотой белка в комплексе с ДНК - прямое доказательство ее сближенности с ДНК. Нашей задачей было установление аминокислот, способных сшиваться с ДНК в спсиифичсском и нсспсцифнчсском комплексах, и локализация мест сшивки на ДНК. Таким способом мы устанавливаем сближенные в составе ДНК - белкового комплекса аминокислоты и основания ДНК.
Методом ДНК-белковой сшивки мы выявили аминокислоты 1ас-репрсссора, взаимодействующие с ДНК. Эта техника была впервые применена для исследования ДНК - узнающих белков. Для идентификации оснований lac-оператора, сшитых с 1ас-рспрсссором был разработан новый метод. В результате исследований было обнаружено, что только лизин-33 сшивается с lac-оператором в специфическом комплексе. В неспецифических комплексах кроме лизина-33 также и N-конец белка сшивается с ДНК. Мы установили, что в тройном комплексе индуктор-репрессор-оператор N-kohcu lac-рспрессора взаимодействует с краями 1ас-оператора. Сделан вывод о том. что в тройном комплексе ориентация ДНК-связываюших доменов lac-рспрессора относительно оператора противоположна той ориентации, которая была ранее установлена для специфического комплекса репрессора с оператором и является ориентацией сго-типа. Присоединение индуктора фиксирует ДНК-связывающие домены репрессора в конфигурации сго-типа и таким образом нарушает поверхность узнавания. Поскольку конфигурация сго-типа хорошо подходит для взаимодействия с ДНК, такой механизм также объясняет как "выключенный" репрессор сохраняет высокую константу связывания с ДНК.
Qfocn работы.
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, изложения полученных результатов, их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы (140 наименований). Работа изложена на 110 страницах машинописного текста и содержит 15 рисунков и 1 таблицу.