Введение к работе
Актуальность проблемы. За последние два десятилетия накоплен огромный экспериментальный материал по структурным свойствам рибосом. Определены общая морфология частицы, первичные структуры рибосомных РНК и белков, предложены модели трехмерной организации прокариотической рибосомы и расположения функциональных центров. Однако вся совокупность имеющихся данных не позволяет однозначно решить проблему точного взаиморасположения структурных элементов рибосомной частицы и построить ее молекулярную модель, которая необходима для полного понимания механизма биосинтеза бежа.
Причина заключается в том, что большинство структурных данных получены более или менее косвенными методами и, следовательно, содержат известную неоднозначность. Перспективы построения достаточно точной молекулярной модели связаны с рентгеноструктурными исследованиями, проведение которых требует, в первую очередь, получения трехмерных кристаллов рибосомных частиц. 30S и 50S рибосомные субчастицы закристаллизованы и ведутся их исследования.
Целью настоящей работы являлось получение кристаллов 70S рибосом, пригодных для рентгеноструктурного анализа /'и их кристаллографические исследования в рентгеновском пучке и методами электронной микроскопии.
Основные задачи исследования. Разработка метода получения кристаллизуемых препаратов рибосом. Получение кристаллов 70S рибосом и выращивание крупных кристаллов для рентгеновских исследований. Определение кристаллографических параметров, электронно-микроскопические исследования кристаллов и определение упаковки рибосомных частиц. Синтез тяжелоатомных лигандов для получения изоморфных производных.
Научная новизна и практическая ценность работы. Разработана методика очистки препаратов рибосом Thermus thermophilus и получены несколько кристаллических форм рибосом. Бипирамидальные кристаллы 70S рибосом выращены до размеров, пригодных для рентгеноструктурного анализа. Определены кристаллографические
параметры бипирамидальных кристаллов. Другая кристаллическая модификация - пластинчатые микрокристаллы, исследованы методами электронной микроскопии. Определена упаковка рибосом в микрокристалле. Данные об упаковке могут быть использованы при решении фазовой задачи в рентгеноструктурных исследованиях прямоугольных кристаллов - третьего типа кристаллов 70S рибосом. Для решения фазовой задачи более классическим методом -методом изоморфных замещений получен тяжелоатомный лиганд -
тРНК , модифицированная золотым кластером AUj х. Модифицированная тРНК сохраняет все функциональные свойства и пригодна для широкого спектра исследований в рентгеноструктурном анализе и электронной микроскопии.
Публикации и апробация работы. По теме диссертации опубликовано II работ (7 статей и 4 тезисов конференций). Материалы диссертации были представлены на Международном симпозиуме "Молекулярная организация биологических структур" (Москва, 1989), Третьей Международной конференции "Кристаллизация биологических макромолекул" (Вашингтон, 1989), 12-м Европейском кристаллографическом съезде (Москва, 1989), Международной конференции "Биосинтез белка" (Путино, 1991), на ежегодных конференциях и конкурсах научных работ Института белка (1988,1989)
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитированной литературы ( llf~ ссылок). Работа изложена на //4 страницах машинописного текста и содержит filT рисунков и 2. таблицы.