Введение к работе
Актуальность теми. Настоящая работа посвяіяена научению Функциональной топографии активного центра ДНК-зависимой РНК-поли-меразы бактериофага Т? (Т7РП) с помощью аффинноп модификации,
ДНК-зависимие РНК-полииерази некоторых фагоз, в частности Т7РП, представляют собой удобные модели для изучения молекулярних механизмов транскрипции. К числу достоинств этих ферментов как объектов исследования относятся небольшой молекулярный вес, одмосуоъелиничныя состав, высокая специфичность в отношении промотора. В то же время фермент осуществляет полнив транскрипционный цикл без участия каких-либо иных белковых Факторов. Изучение кинетики действия ферментов позволяет получить информацию о механизмах ферментативной реакции. Весьма актуально также использование ингибиторов различной природу для выяснения структуры активного центра фермента.
[[ели и задачи исследования. Целью данной диссертационной работы было изучение активного центра Т7РП и возможности идентификации аминокислотных остатков, участвующих в его формировании. Научная новизна работы. Исследовано взаимдеяствие Т7РП с рядом аналогов GTP, в том числе содержащими реакционноспособные группировки. Выявлен ряд конкурентных и необратимых ингибиторов фермента.
Обнаружено, что модификация аминокислотного остатка Lys 172, локализованного в междомениой области приводит к полному подавлению Ферментативной активности. Показано, что зтот остаток не принадлежит к активному центру фермента, но
пространственно сближен с последним, и его модификация создает препятствия для связывания промотора и инициирующего нуклеозид-трифосфата и, тем самым, протекания ферментативной реакции.
Выявлено, что при ограниченном протеолиэе фермента присутствие промотора в среде препятствует дальнейшему протеолизу малого N-концевого домена, что указывает на одновременное взаимодействие промотора с обоими доменами.
Практическая ценность работы. Полученные в работе данные позволяют составить определенное представление о некоторых особенностях Функционирования Т7РП, в частности, о топографии центра связывания СТР. С другой стороны, они позволяют сформулировать ряд требования к стуктурё соответствующих соединении, что открывает перспективы для направленного синтеза эффективных ингибиторов Т7РП.
Апробация. Материалы диссертации были доложены на 14 Международном биохимическом конгрессе (Прага. 19S8). Советско-итальянском Симпозиуме "Макромолекулы с функционирующей клетке" (Ленинград, 1086). VIII Двустороннем симпозиуме СССР-ФРГ (Иркутск, 1989), 19* Конференции ФЕБО (Рим, 1963), Советско-британском симпозиуме "Регуляция транскрипции" (Москва, 1990). Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 печатные работы.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 81 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов и списка литературы, включающего 93 наименований. Диссертация содержит 19 рисунков и б таблиц.