Введение к работе
Актуальность работы. Развитие методов генетической инженерии и молекулярной биологии, накопление данных о клонировании и вкспрессии генов позволяет успешно решать задачи получения в клетках белков и пептидов, важных как для фундаментальных исследований, так и необходимых в народном хозяйстве. В настоящее время одним из популярных объектов для получения методами генетической инженерии целевых белков и пептидов стали дрожжи s.cerevisiae. Возможность получения продукта в секрвтируемой форме является одной из немаловажных причин этой популярности. Преимущества такого подхода определяются несколькими обстоятельствами.
Во-первых, получение белка в секретируемом виде существенно упрощает и удешевляет процедуры выделения и очистки рекомбинантных белков. Кроме того, белок, находящийся в культуральной жидкости, не подвергается воздействию клеточных протеаз.
При экспрессии целого ряда белков млекопитающих в клетках Е.соїі возникают т.н. тельца включения, содержащие продукт в нерастворимом виде. Ясно, что накопление больших количеств чужеродных белков в цитоплазме влияет на жизнеспособность клетки, вследствие этого увеличивается вероятность потери или перестройки рекомбинантной плазмиды, направляющей экспрессию. Выведение белка из клетки через секреторный поток хотя бы частично снимает эти проблемы.
Прохождение йелком секреторного пути позволяет получать целевой продукт в зрелой, биологически активной форме: обеспечивается правильное сворачивание (фолдинг) полипептидной цепи и образование дисульфидных связей, продукт подвергается посттрансляционным модификациям (гликозилирование и протеолитический процессинг). Таким образом, секреция гетерологичных белков позволяет разрешить ряд проблем, возникающих при создании штаммов-продуцентов целевых белков.
К настоящему времени созданы штаммы-продуценты дрожжей s.cerevisiae, секретирующие гетерологичные белки в культуральную жидкость. Спектр этих белков довольно широк и включает в себя
различные ферменты, гормоны, факторы роста, лимфокины и другие
беЛКИ И ПеПТИДЫ. Наиболее ШИрОКО ДЛЯ ДрОЖЖеЙ S.cerevisiae
применяется система экспрессии/секреции на основе пре-про-сегмента а-фактора. Число гетерологичных белков, секрецию которых в этом случае удалось показать, приближается к нескольким десяткам. Использование пре-про-сегмента гена MFal в большинстве случаев обеспечивает высокие уровни секреции целевого продукта.
Цель работы. 1. Клонирование генов MFal , GPD1 И ADH2 s.cerevisiae. 2. Создание дрожжевых секреторных векторов на основе регуляторних последовательностей клонированных генов и пре-про-последовательности а-фактора. 3. Получение штаммов дрожжей, секретирующих в культуральную среду гормон роста человека, эпидермалышй фактор роста человека, натрийуретический фактор человека и кальцитонин человека.
Научная новизна и практическая ценность работы Клонированы
фрагменты ГеНОВ S.cerevisiae MFal, GPD1 и ADH2. Создано
семейство секреторных векторов дрожжей на основе промоторов клонированных генов и пре-про-последовательности а-фактора. Созданы штаммы дрожжей, с высокой эффективностью секретируюшие гормон роста человека в культуральную среду. Определена зависимость эффективности секреции гормона роста под контролем различных промоторов от концентрации и типа источника углерода в среде роста. Получены штаммы дрожжей, секретируюшие в культуральную жидкость эпидермальный фактор роста человека, натрийуретический фактор человека и кальцитонин человека. Разработан метод быстрого выделения плазмидной ДНК из е. со і і для секвенирования по методу Сэнтера.
Результаты данной работы составляют основу для прикладных разработок по секреции гетерологичных белков дрожжами s.cerevisiae. На основе полученных штаммов дрожжей, секретирующих целевые белки в среду роста, возможно провести технологические разработки промышленных штаммов-продуцентов данных белков.
Апробация работы Материалы диссертации были представлены на 9 конференции молодых ученых, Рига, 1987 г.; на 8 двустороннем симпозиуме СССР - Франция "Молекулярная биология генов и нуклеиновых кислот", Москва, 1986 г.; на 4 Международном
конгрессе по клеточной биологии, Монреаль, Канада, 1988 г.; на 14 Международном биохимическом конгрессе, 1988 г.; на 7 симпозиуме СССР - ФРГ "Организация и функционирование зукариотического генома", Гейдельберг, ФРГ, 1987 г.; на 15 Международной конференции по молекулярной биологии и генетике дрожжей, Гаага, Нидерланды, 1990 г.; на семинаре отдела Генетической инженерии ИМБ АН СССР, Москва, 1990 г.
Структура и объем диссертации Диссертация состоит из введения, трех глав, выводов и списка литературы. Она изложена на страницах, содержит рисунков и библиографический список из названий.