Введение к работе
Актуальность проблемы. Создание эффективных бесклеточных систем для синтеза и экспрессии РНК является актуальной проблемой молекулярной биологии и биотехнологии. Одним из наиболее перспективных направлений является использование для этой цели репродуктивной системы фага QP - РНК-содержащего бактериального вируса.
С одной стороны, Q/3 репликаза является единственной известной РНК-зависимой РНК полимеразой, позволяющей экспоненциально размножать РНК in vitro. Экспоненциальный синтез РНК наблюдается при молярном избытке фермента и обеспечивается способностью Qfi репликазы использовать в качестве матрицы не только исходные однонитевые РНК, но и однонитевые же комплементарные копии. Использованию Qfi репликазы для синтеза заданных РНК in vitro препятствовала ее узкая матричная специфичность. В то же время, помимо Q/3 РНК существует целый класс РНК небольшого размера - природных сателлитов фага Q/3 (RQ РНК, длиной 80-250 нт), которые размножаются in vitro даже быстрее, чем Q/3 РНК. Было установлено, что RQ РНК могут служить в качестве . векторов для размножения коротких (до 100 нт) чужеродных последовательностей, но более длинные вставки лишают RQ-вектор способности к размножению Q/3 репликазой in vitro. Выяснение причин неспособности RQ-векторов нести длинные чужеродные последовательности важно для понимания механизма репликации РНК, а преодоление этого ограничения имеет большой практический интерес, поскольку позволило бы размножать любые матрицы для бесклеточных систем трансляции и осуществлять клонирование генов in vitro с помощью недавно изобретенной техники молекулярных колоний.
С другой стороны, геномная РНК Q/3 фага t Q/3 РНК) является одной из наиболее эффективных матриц для трасляции in vitro и -в силу этого - одним из излюбленных объектов молекулярной биологии. Недавно было продемонстрировано, что трансляция чужеродных мРНК, вставленных в Q|3 РНК вместо цистрона белка оболочки, усиливается на 1-2 порядка. Однако практическому использованию Q/3 РНК в качестве трансляционного вектора мешают ее большой размер (более 4000 нт) и сопутствующий синтез фаговых белков. Поэтому важно было выяснить, могут ли RQ РНК и редуцированные варианты Q(3 РНК служить эффективными векторами
для трансляции мРНК в бесклеточных системах. Решение этой задачи имеет особое значение для повышения эффективности проточных систем трансляции (CFCF-систем), используемых для препаративного синтеза индивидуальных белков вне клетки.
Цель исследования. Целью данной работы явилось создание РНК-векторов на основе RQ РНК и делеционных вариантов Q(3 РНК для репликации, трансляции и сопряженной репликации-трансляции мРНК и исследование их свойств в бесклеточных системах.
Задачи исследования, в работе решались следующие задачи:
(1) Клонирование в виде кЛНК под Т7 промотором (+) и (-)
версий нескольких RQ РНК.
(2) Конструирование РНК-векторов на основе наиболее
эффективной е репликации RQ РНК и делегированной Q0 РНК (hQp
РНК) и исследование их способности к репликации.
(3) Конструирование на основе полученных векторов
рекомбинантных РНК, несуших ряд клеточных мРНК (RQ-мРНК и
AQ(3-mPHK, соответственно).
(4) Исследование свойств RQ-мРНК в бесклеточных системах
репликации, трансляции и сопряженной репликации-трансляции из
Escherichia col і.
(5) Определение влияния 5'- и 3- концевых участков
RQ-вектора на эффективность репликации и трансляции RQ-mPHK.
(6) Сравнение эффективности RQ- и Д<2|3-векторов в трансляции
мРНК in vitro.
Научная новизна работы. Выделена новая эффективно реплицирующаяся RQ РНК. На ее основе создан вектор для внеклеточного размножения и экспрессии мРНК.. Впервые осуществлена сопряженная репликация-трансляция мРНК in vitro. Выяснена причина и преодолена неспособность RQ-вектора, несущего длиніше чужеродные вставки, размножаться Q/3 репликазой в бесклеточной системе. Продемонстрирована способность RQ РНК служить эффективным вектором для внеклеточной экспрессии мРНК, а также синергизм процессов репликации и трансляции RQ-mPHK. Обнаружен эффект защиты mFHK в составе RQ-вектора от эндогенных рибонуклеаз и установлена роль взаимодействия Б'- и 3'-концевых участков вектора в этом эффекте. Получен делеционный вариант QP РНК длиной 620 нуклеотидов (AQ|3 РНК), в котором сохранены 5'- и 3'-концевые участки фагового генома. Обнаружена исключительно
высокая эффективность AQ/3 РНК в качестве вектора для внеклеточной трансляции мРНК, достигаемая благодаря необычно длительной линейной фазе кинетики белкового синтеза. Установлено, что причиной этого эффекта является повышенная устойчивость к рибонуклеазам Д<2/3-мРНК, ассоциированной с транслирующими рибосомами. Продемонстрирована высокая эффективность трансляции AQp-мРНК в проточных белоксинтезирующих реакторах.
Практическое значение работы. Полученные в данной работе РНК-векторы могут быть использованы для создания высокопродуктивных систем трансляции и сопряженных систем репликации-трансляции. RQ-векторы могут быть также использованы для клонирования генов и тестирования различных биологически значимых последовательностей с помощью техники молекулярных колоний. Помимо этого, RQ-мРНК когут служить в качестве модельных матриц для изучения репликации, трансляции и сопряжения репликации - трансляции in vitro. Таким образом, предложенные РНК-векторы могут найти широкое применение в различных областях молекулярной биологии, биотехнологии и медицины.
Апробация работы. Материалы диссертации представлены на международной конференции "Frontiers in Bioprocecsing II" (Еоулдер, Колорадо, США, 1990),Первой Германо-Российской летней школе по бксклеточным системам (Берлин, Германия, 1994) и на научных конференциях Института белка РАН (Пущино, 1993, 1994). Диссертация апробирована на заседании Отдела структуры и функций рибосом Института белка РАН (Пущино, 1995).
Публикации. Материалы диссертации изложены в 8 опубликованных работах и подана заявка на получение международного патента.
Структура диссертации. Диссертация включает введение и четыре основные части: обзор литературы "Реплицирующиеся РНК как потенциальные векторы для экспрессии и размножения чужеродных последовательностей", "Материалы и методы", "Результаты экспериментов", "Обсуждение результатов". Диссертация завершается выводами и списком литературы ( t2-t ссылок) . Работа изложена на 1Ь2- страницах машинописного текста и иллюстрирована 31 рисунками.