Введение к работе
Актуальность проблемы. Проблема взаимосвязи структуры и функции биологических молекул всегда была центральной в молекулярной биологии. Для белков эта взаимосвязь наиболее интересна и, по-видимому, наиболее сложна. Исследование такой взаимосвязи не может быть ограничено каким-либо одним методом или подходом. Наряду с классическими задачами: классификация последовательностей, построение филогенетических деревьев, предсказание вторичных и третичных структур и т. д., - все более актуальной становится задача поиска закономерностей, связывающих структуру белка с его биологической активностью или свойствами. Наличие информации о структуре и расположении функционально важных районов в белках не дает полного понимания причин, определяющих варьирование значений активности у различных белков со сходными структурой и функцией. Актуальность проблемы взаимосвязи структура-активность в первую очередь связана с тем, что данный анализ позволяет получить такую информации.
Развитие методов генной инженерии привело к быстрому накоплению информации о структуре и биологической активности многих белков. Ведутся интенсивные работы по созданию модифицированных форм белков, обладающих улучшенными медико-биологическими характеристиками. Такие работы, как правило, требуют больших затрат и часто осуществляются методом проб и ошибок. Создание теоретических методов анализа взаимосвязи структура-активность позволит выявлять районы, важные для активности белков и рационально планировать белково-инженерные эксперименты.
Пель настоящего исследования заключалась в разработке методов, позволяющих а) устанавливать взаимосвязь структура-активность в семействах гомологичных белков; б) исследовать структурно-функциональную организацию важных для медицины и биотехнологии белковых семейств и в) планировать белково-инженерные эксперименты по направленному изменению их свойств.
При этом решались следующие задачи:
-
Разработка алгоритмов автоматической генерации и проверки гипотез о связи между биологическими свойствами белков и физико-химическими характеристиками сайтов в выровненных последовательностях или третичной структуре белков с использованием множественного линейного регрессионного и канонического дискриминантного анализа.
-
Разработка метода оценки корреляций между активностью гомологичных белков и аминокислотными заменами в непрерывных и пространственных сайтах.
-
Разработка алгоритма поиска мотивов в комбинаюрных библиотеках пептидов, связанных со способностью данных пептидов имишровагь антигенные эшпопы белков
-
Создание компьютерных программ, реализующих разработанные методы и алгоритмы
-
Поиск модулирующих активность районов и их сопоставление с известными функциональными участками в белках на примере пяти семейств (дезинтегрнны. интерфероны-а человека, люциферазы жуков, белки М2 вируса гриппа А, ингибиторы протеиназ).
-
Анализ взаимосвязи между структурой и активностью фактора некроза опухолей человека. Планирование мутаций, целенаправленно меняющих биологические свойства этого белка.
-
Анализ взаимосвязи между структурой и свойством пептидных фрагментов, встроенных в основной белок оболочки бактериофагов М)3, fl и fd.
-
Локализация группоспецифнческого, гемагглютинирующего эпитопа гликопротеина Е2 альфавирусов по данным анализа фаговой комбинаторной библиотеки пептидов.
Теоретическая и практическая ценность. Разработанные в настоящей работе методы и полученные результаты могут быть использованы в дальнейшем для теоретического и экспериментального исследования структурно-функциональной организации глобулярных белков, при планировании экспериментов по белковой инженерии. Предложенные мутации, снижающие цитотоксическую активность и обеспечивающие пролонгированное действие фактора некроза опухолей человека, могут быть использованы при создании новых эффективных противоопухолевых лекарственных препаратов, а данные по локализации группоспецифического, гемагглютинирующего эпитопа гликопротеина Е2 альфавирусов - при создании средств профилактики и диагностики вызываемых этими вирусами заболеваний.
Методы исследования. Для множественного выравнивания белковых семейств использовался метод и программа CLUSTALV (Higgins & Sharp, 1989). Предсказание вторичной структуры белка Е2 VEE проводилось методом PHD (Rost & Sander, 1994). Все результаты анализа взаимосвязи структура-активность в семействах гомологичных белков и планирования экспериментов по белковой инженерии получены с использованием методов и алгоритмов программы ProAnalyst (Иванисенко и Ерошкин, 1997).
Научная новизна. Впервые предложен метод оценки максимально достижимого значения корреляции между совокупностью всевозможных характеристик анализируемого сайта во множественном выравнивании гомологичных белков и биологическими свойствами данных белков.
Разработаны методы количественного анализа взаимосвязи структура-активность/свонство в семействах родственных или мутантных белков с использованием множественного линейного регрессионного и канонического дискримннантного анализа. Впервые на основе данных методов разработана программа, позволяющая проводить комплексные исследования по взаимосвязи структура-активность белков и планированию замен, направленно меняющих биологические свойства белков. В отличие от существующих программ данная программа реализует многостадийную компьютерную технологию анализа взаимосвязи структура-активность
Впервые проведено исследование распределения во множественном выравнивании гомологичных белков корреляций структура-активность, обладающих максимально достижимыми значениями для анализируемого семейства На примере пяти белковых семейств показано, что сайты и отдельные позиции, замены в которых, коррелируют с активностью белкой (или фенотнпическими признаками организмов), располагаются в функционально или структурно важных районах данных белков либо рядом с ними
Впервые обнаружено, что цитотоксическая активность фактора некроза опухолей линейно коррелирует с изменениями индексов Р-поворота и изоэлектрической точки аминокислот в функционально важной пегле, а растворимость мутантных форм белка в клетках К. сої і коррелирует с изменениями физико-химических и структурных характеристик аминокислот
Впервые обнаружена связь между способностью к сборке вирусных часпщ бактериофагов М13, П и й и наличием положительно зарчженных аминокислот во встроенных участках обо.точечных белков
В результате анализа данных по фаговой комбинаторной библиотеки пептидов найдены участки возможной локализации группоспецифического, гемагглютинируюшего эпитопа гликопротеина Е2 альфавирусов. Предложена модель пространственной упаковки участка гликопротеина Е2. Полученные результаты являются новыми
Публикации По теме диссертации опубликовано 6 ст».тей в рецензируемых п маниях и 4 тезисов докладов на Международных и Российских конференциях
Структура работы. Работа состоит из Введения, пяти Глаз, Выводов и Примечаний. В конце каждой главы приводится заключение с кратким анализом результатов и основными выводами данной части исследования Работа изложена на М4 страницах машинописного текста, содержит 22 рисунка и 21 таблицу Список цитируемой литературы состоит из 15S ссылок-