Введение к работе
Актуальность темы. Для понимания механизма биосинтеза белка необходимы функциональные и структурные исследования рибосом. Наиболее изученными являются бактериальные рибосомы, и в первую очередь, рибосомы Escherichia coli. Все белки из рибосон Е. coli (их свыше 50) были выделены и охарактеризованы с помощью различных физико-химических методов, кроме того определены их первичные структуры. Однако попытки кристаллизации рибосомных белков Е. coli и определения их пространственной структуры методом рентгеноструктурного анализа натолкнулись на серьезные трудности. В связи с этим в последние годы начались исследования рибосомных белков из двух других микроорганизмов - термофильных эубактерий: Bacillus stearothermophilus и Thermus therrnophilus, белки которых более стабильны и поэтому более перспективны для кристаллизации, в Институте белка РАН было выделено и охарактеризовано свыше 40 рибосомных белков Т. therrnophilus, для рибосомных белков S6, S7, S12, S15, LI, L11 определена первичная структура, несколько белков закристаллизовано и для белка S6 определена пространственная структура с высоким разрешением.
Настоящая работа является частью комплексных исследований
рибосомных белков из Т.thermophilus, ведущихся в Институте белка,
и направлена на определение первичной структуры ряда рибосомных
белков путем клонирования и секвенирования кодирующих их генов.
Установление первичной структуры легко кристаллизующихся
рибосомных белков из Т. therrnophilus и получение
штаммов-суперпродуцентов для выделения этих белков в препаративных количествах приведут к новому качественному уровню исследований структуры рибосомных белков и рибосомы в целом.
Основные задачи работы:* Клонирование генов рибосомных белков S10 и spc оперонов Т.therrnophilus. Определение первичной структуры генов rpsl7, rpll4, rp224, rpsl4, rps8, кодирующих рибосомные белки S17, L14, L24, S14, S8 Т. therrnophilus. Анализ особенностей первичных структур генов S10 и spc оперонов Г. thermopftilt/s и кодируемых ими рибосомных белков. Получение штамма-суперпродуцёнта для белка-репрессора S8 и определение его некоторых физико-химических характеристик.
Научная новизна. В настоящей работе клонированы полный S10 оперон и 10 генов рибосомных белков spc оперона Т. therrnophilus. Определена полная последовательность гена rpsl7 из S10 оперона и
генов fplli, грігі, rpsl4, rpsS из spc оперона. Обнаружено, что в отличие от мезофильных бактерий в T.thermophilus S10 и spc опероны не разделены спенсером: терминирующий кодон последнего гена (rpsl7) S10 оперона перекрывается с инициирующим кодоном первого гена (rpI14) spc оперона. В конце гена rpsl7 локализован участок предполагаемого связывания белка-репрессора S8. Проведено сравнение первичных структур рибосомных белков S17, L14, L24, S14, S8 T.thermophilus с аналогичными белками из других эубактерий. Получен штамм-суперпродуцент для рибосокного белка S8 из T.thermophilus и отработана методика выделения белка. Из спектров кругового дихроизма определено количественное содержание элементов вторичной структуры белка S8. Показано, что белок S8 из T.thermophilus обладает высокой устойчивостью к денатурирующим агентам.
Структура диссертации. Диссертация состоит из трех основных частей: обзора литературы, экспериментальной части и обсуждения результатов и завершается выводами и списком цитируемой литературы ( /4Ф ссылок). Работу иллюстрируют 32 рисунка и 6 таблиц, общий объем диссертации - /W страниц.
Апробация работы и публикации. Результаты докладывались на научных конференциях Института белка РАН (Пущино, 1993, 1994). По теме диссертации опубликованы две печатные работы. В банк последовательностей нуклеотидов EMBL (г.Гейдельберг) помещены первичные структуры генов rpsYl (accession NO.Z36971), rpI14 (accession NO.Z37993), rp!24 (accession NO.Z31717), rpsl4 (accession Ho.Z31553).