Введение к работе
Актуальность теяп.г. Изучение внеклеточных микробных рибонуклеаз (РНКаз), катализирующих неспецифическую деградацию РНЬС, представляет интерес как с научной, так и с практической точки зрения. Среди этих ферментов наиболее изучена группа лизкомолекулярных циклизующих рибонуклеаз, сегрегируемых некоторыми видами грибов, стрептомицетов и бацилл [3.1.4.23]. Несмотря на таксономическую удаленность этих организмов, секретируемые ими РНКазы составляют одно структурно-гоиолоптчное и эволюционно-родствешюе семейство. Области структурной гомологии находятся в районе активного центра, в еубстратсвязывающем центре и гидрофобном ядре феркегп-а, т.е. эволюционные изменения затрагивали участки, расположенные вне функционально значимых сайтов РНКаз. Внеклеточных РНКазы бацилл имеют значительно отличаются по своей структуре от РНКаз грибоз и стрептомицетоь. Однако, внутри рода бацилл эти ферменты удивительно консервативны и являются удобным объектом для изучения молекулярной эволюции ферментов.
Внеклеточные рибонуклеази микроорганизмов являются также модельным объектом структурно-функциональных исследований, включающих проблемы сворачивания полипептидов я структурные основы биологической специфичности. Эти исследования создают необходимые предпосылки для эффективного использования РНКаз в научных и прикладных целях.
В настоящее время интенсивно разрабатываются аспекты практического применения, рибонуклеаз, что связано прежде всего с введением в практику микробных ферментов - более разнообразных, активных и стабильных, чем ферменты высших эукариот. Внеклеточные РНКазы микроорганизмов используются в растениеводстпе, в медицине я в лабораторной практике.
Возможности изучения и практического применения микробных рибонуклеаз могут быть реализовали в подпой мере только пои наличии широкого спектра клонированных геяоз этих ферментов. Исследование ыолекулярно-генетической структуры этих 'РНКаз является позволяет уточнить также механизмы регуляции их синтеза, процесеинга л секреции. Кроме того, клонирование
- г -
соответствующих генов и создание эффективны:: систем Експрессзш
необходимо для проведения .структурно-функциональных
исследований.
Для сравнительного анализа, затрагивающего временные и адаптационные аспекты эволюции ферментов,, особый интерес представляют рибонуклеази микроорганизмов, выделенных и> мерзлотных пород. Установлено, что в условиях вечной мерзлоты происходит консервация микроорганизмов, существовавших на планете многие тысячи лет назад. Среди штаммов Bacilli, выделенных мерзлотных грунтоз Колымской низменности, было обнаружено несколько штаммов-продуцентов РНКаз, в тоы числе штамм Bacillus circulans BCF247, возраст'которого оценивался в C,JJ млн. лет. Этот штамм секретировал РНКазу, прокшідвщую структурное и функциональное сходство с другими внеклеточными РНКазами бацилл.
Цель работы. Основной задачей настоящей работы было. клонирование и определение последовательности нуклеотидов гена внеклеточной РНКазы В. сігсиіаяв (РНКазы Всі), исследование окружения гена на хромосоме; разработка системы сайт-специфической интеграции чужеродной ДНК в Xatf-сайт хромосомы. Е. coli и интеграция в него гена РНК полямэразы бактериофага Т7; конструирование на основе полученного таким образом штамма системы дія терморегулируемой экспрессии генов РНКаз на модели баранзы в слетках Е. coli; конструирование системы экспрессии генов бациллярных РНКаз, индуцируемой с помощью ИПТГ.
Научная вевизна работы. Клонирован ген внеклеточной щелочной рибонуклеази В. circulans. Показано, что данный гея зкспрессируется в клетках Е. coli с использованием собственных регуляторних сигналов, а активная РНКаза секретируется метками ь среду роста. Определена полная вуклеотидная последоватолькозть РНКазы Всі. Сконструирован вектор для экспрессии внеклеточной. РНКазы В. amylaUquefaciens под контролем тандема промоторов г'ло и -\ас> направляющих транскрипцию генов РНК полимеразами бактериофага Т7 и Е. coll. С использованием элементов интегративкого модуля умеренного бактериофага X сконструирована система для
высокоэффективной стабильной сайт-специфической интеграции чужеродной ДШС в ;Ш-сайт фага X хромосомы Е. cell. С помощью разработанной системы в хромосому Е. cell введен ген РНК пелимеразы бактериофага Т7 под контролем термоиндуцхбельного промотора. Полученный штамм использован для термонндупибельной экспрессии гена аиеклеточной РНКазы В. anuloliquefacienz. На основе штамма Е. coll SJ.21(DE3) разработана более эффективная система экспрессии, индуцируемая с помощью ИПТГ.
.Практическая цеппсетт. работы. Скоиструкровапнзп система экспрессии ггпа РНК.езы Всі позволяет получать белковый продукт в значительных количествах, что существенно упрощает процедуру очистки белка. Полученный с помощью данной зкстфессисшгой системы белок используется для структурно-функциональных несле-геиаыш. Разработанный метод сайт-спсцкфической интеграции чужеродной ДНК в ХаИ-съуг: хромосомы . cnli являет" удобны;.: генпсшпкепсрЕШ.; кпс,тр\хепточ ц ложет быть использован для решения как няучянг., так и научио-практачёмих задач. Полученный с помощь*) зтего метсда штамм Е. соіі, в хромосому которого был 'гатсгрігго"зн ген Т7 РНК полккеразы под контролем термоиндуцкбельного промотора, моглет найти широкое применение и бпотехиологми для rcTf-рологичной экспрессии генов РНКаз.
Лоробация. Осиовние положения диссертационной работы были
представлені.! на VI ксніерепции РФ "Новые направления
биотехнологии" (1994), International Symposium on the Biology of
Actinomycstes (1904).
Структура работы. Диссертация состоит из введения, литературного обзора, гкеперимептальгой части, содержащей глазы "Материалы и истоды", "Результатів" и "Обсуждение", выводов и списка цптнрагалией литературы, включающего 154 наименования. Работа изложена на 120 страницах, включает 21 рисунок и 7 таблиц.
Публикации. По материала!.! диссертации опубликовано шесть печатных работ. ' -