Введение к работе
Актуальность проблемы. Развитие исследований в области генетики фотосинтеза связано с познанием структуры генома хлоропласта и его взаимодействия с основным наследственным аппаратом клетки - ядром. В настоящее время подробно охарактеризованы хлоропластные ДНК многих растений, в том числе целиком секвенирова-ны хлоропластные ДНК табака, печеночника и риса. В то хе время организация хлоропластной ДНК такой агрономически важной культуры как хлопчатник практически не изучалась. Кроме того, изучение структуры клонированных генов является необходимым этапом в изучении механизма регуляции их экспрессии. Несмотря на обилие структурных данных по организации хлоропластных генов, общие закономерности механизма регуляции их экспрессии изучены недостаточно. В последнее время получены указания на ограниченную роль транскрипции в регуляции экспрессии генов хлоропластов, однако, подробности такого типа регуляции до сих пор не выяснены.
Хлоропластный ген psbA кодирует белок с молекулярным весом 32 кД - один из компонентов фотосистемы- II, выполняющий функцию переносчика вторичных электронов, в комплексе с пластохиноном. В литературе этот белок иногда называют гербицид-связывающим, поскольку он может связываться с гербицидами - ингибиторами фотосинтеза, в частности, с атразином. При этом нарушается его комплекс с пластохиноном и способность участвовать в фотосинтезе. Известны мутантные формы этого белка (вызванные точечной мутацией в гене), приводящие к неспособности к связыванию с гербицидом и, как следствие, к устойчивости растения к гербицидам этого класса. Поскольку гербицид-устойчивость является одним из основных направления развития генетической инженерии растений, ген psbA может иметь значение и для биотехнологических целей.
Цель и конкретные задачи исследования. В связи с вышесказанным представляется актуальной работа по клонированию и характе-ризации гена psbA хлопчатника, кодирующего 32 кД гербицид-связы-вающий белок тилакоидной мембраны хлоропластов, и изучение его экспрессии на уровне продуктов транскрипции гена. Конкретной задачей работы являлись выделение и гибридиэационный анализ хлоропластной ДНК хлопчатника, клонирование гена psbA хлопчатника, определение нуклеотидной последовательности гена, картирование
его транскриптов, сравнительный анализ нуклеотидной последовательности p_sbA гена и его продукта с аналогичными последовательностями из других растений.
Научная новизна и практическая значимость работы. Впервые получена рекомбинантная плазмида, содержащая фрагмент хлоропласт-, ной ДНК хлопчатника, несущий гены psbA, trnH и trnK. Также впервые определена полная нуклеотидная последовательность psbA и trnH генов хлопчатника и регуляторних областей psbA гена, картированы 5'- и 3'-концы psbA транскрипта. Впервые обнаружена гетерогенность 5'-конца psbA транскрипта, что вероятнее всего является результатом посттранскрипционного процессинга и предположительно может иметь регуляторное значение. Впервые с помощью РНК-гибридизации было показано, что psbA ген хлопчатника экспресси-руется на уровне транскрипции с образованием трех транскриптов.
Полученные результаты в некоторой степени дополняют и конкретизируют представления об организации, структуре и экспрессии генов хпДНК у высших растений. Данные о степени консервативности в кодирующих областях гена могут быть рекомендованы для использования в геносистематике и молекулярной филогенетике. Данные по транскрипции psbA гена хлопчатника могут служить моделью для изучения механизма регуляции экспрессии хлоропластных генов. Поскольку psbA ген кодирует гербицид-связывающий белок, клонированный ген может быть использован для получения мутантного гена с целью его введения обратно в растения для придания им признака гербицид-устойчивости (после разработки эффективной системы трансформации хлоропластов).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 работ. Результаты исследований докладывались на Всесоюзной конференции "Новые направления биотехнологии" (г.Пущино, 1988,1990), на IV Всесоюзной конференции молодых ученых по физиологии растительной клетки (Минск, 1990), на V международной молодежной конференции по генетике (Албена, Болгария, 1990), на ежегодной научной конференции молодых ученых ЙОГ АН СССР (Москва. 1990).
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов и списка литературы, включающего 179 наименований. Работа изложена на 125 страницах машинописного текста и содержит 28 рисунков и 3 таблицы.