Введение к работе
Актуа пьность исследования. Метионин представляет собой одну из незаменимых аминокислот у дрожжей, участвующих в биосинтезе клеточного белка и переносе метилового радикала в клетках через промежуточный продукт - 5-аденоэнл-иетионин (SAM).
Сведения, полученные ранее при изучении ферментных систем, входящих в цикл биосинтеза метионина (рисі) в различных условиях культивирования диких и мутантных штаммов дрожжей, показали, что:
процесс биосинтеза метионина регулируется путем изменения уровня синтеза нескольких ферментов (Antoniewski.Robichon-Szulmajster, 1973);
в этом процессе принимают участие по меньшей мере 5 ферментов, имеющих одинаковую систему регуляции:сульфат-пермеаза.АТФ-супьфу-рилаза, аденозил-фосфосульфаткиназа, супьфитредуктаза и гомоци-стеинсинтетаза. Структурные гены этих ферментов генетически не связаны и автономно функционируют в клетках; регуляторними сигналами этих генов являются S-аяенозип-иетионин (SAM) и DL-метионин (Cherest et al.,1969,1973; Breton,Surdin-Kerdan,1977);
в регуляции биосинтеза метионина могут принимать участие некоторые ассоциированные формы метнонин-аденозилтрансфераз (Cherest, Surdin-Kerdan, 1981), катализирующих превращение метионина в SAM.
Известно,что у дрожжей, наряду с "общин" путем регуляции биосинтеза аминокислот, существуют специфические механизмы регуляции, характерные для каждой из аминокислот (Delforge et al., 1975; Uolfner et al.,1975; 11 ieJerberger et al.,1981; Carsiotis et al.,1965; Stephens et al.,1975). Ранее для некоторых аминокислот (гистидпна (5truhl,1982; Donahue et al.,1983) и триптофана (Zaikln, Vanofsky, 1982)) было показано, что "обший" путь регуляции реализуется на транскрипционном уровне, в то время как специфическая регуляция, например, биосинтеза аргинина (Hesenguy, Dubois, 1983) является посттранскрипцнонной. Для метионина этот вопрос не бып изучен. Настоящая работа привела к пониманию регуляции синтеза АТФ-сульфурилазы, кодируемой геном met3 и катализирующей один из этапов синтеза метионина.
Цепь работы. Целью настоящей диссертационной работы было клонирование структурного гена raet3, кодирующего АТФ-супьфурилазу, и изучение его экспрессии в клетках дрожжей в различных условиях культивирования.
- г -
Для достижения данной цели последовательно решалось несколько задач:
-
получение банка генов S.cerevisiae, штамм D2B;
-
выделение фрагмента ДНК дрожжей, содержащего ген raet3, путем отжига его с химерным плазмидным вектором pFLi (Cheuallier et al., 1979), сконструированном из бактериальной плазмиды pBR322, дрожжевой плазмиды 2$л и гена игаЗ дрожжей; получение характеристик и рестрикционной карты этого гена;
-
исследование экспрессии гена met3 в клетках дрожжей в различных условиях культивирования и выяснение механизма регуляции биосинтеза АТФ-сульфурилазы.
^Cn^FT^T
1 СУ'1Ы
ГА~
гомосерин йфі":
ФАФС
І ІІІЙІІїС-РН^ЗУКТлОЗ.^
ф *їТПЄРМЄ4л ^3
и-дцєтіі/1-
-L-ГОМОСЕРИН
y.-'Ifc-fMTF-Exjy^. Т .-Ц2.-4
3-^^ЄНОЇ И.'Ї-МКТИОНИН
Рис.1. Цикл биосинтеза метионина (упрощенная схема - по Breton et al., 1977): АФС - аденозин 5'-фосфосульфат, ФАФС - 3'-фосфоаденозин-5'-фосфосульфат.
Новизна исспеповання. С помощью химерного плазмидного вектора рГЫ впервые изучена экспрессия гена met3 в клетках дрожжей и показано, что специфическая регуляция этого гена, кодирующего АТФ-сульфурилазу, осуществляется на уровне транскрипции. Впервые установлен размер структурного гена met3, равный 1,7 т.п.н., и построена его физическая карта.
Практическое значение. Получен банк нуклеотшшых последовательностей дрожжей, применяемый для выделения различных структурных генов дрожжей. Сконструированная в работе серия ппазмид на базе химерного плазммдного вектора pFLi успешно применена в ген-ноинженерных исследованиях дрожжей. Выделенный в работе структурный ген met3, кодирующий АТФ-сульфурилазу, может служить в качестве маркера при изучении процессов транскрипции и трансляции у дрожжей.
Апробация. Результаты исследовании докладывались и обсуждались на научных семинарах лаборатории энзимололш Национального центра научных исследовании Франции и на сешшарах и ежегодных научных конференциях Института экспериментальной биологии Национального центра научных исследовании СРВ (Хошимин).
Публикации. По результатам выполненных исследований имеется 8 печатных работ.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, четырех глав и выводов, содержит Л 2 О страницы машинописного текста, ? рисунков и 7 таблиц. Список использованной литературы включает ZiS наименований.