Введение к работе
Актуальность темы исследования. Разработка технологии рекомбинантной ДНК явилась основой крупных успехов молекулярной биологии при изучении структуры и функции генов, а также решения практических задач биотехнологии. Применение этой технологии к анализу генома высших организмов и, в частности, для физического картирования; до недавнего времени осложнялось тем, что предел чувствительности цитогенетических методов состаапял несколько миллионов нуклеотидов, а методы молекулярного клонирования позволяли оперировать с фрагментами до 50 т.п.н. Эту брешь удалось закрыть при разработке новых методов манипулирования крупными фрагментами ДНК; электрофореза в пульсирующем поле (пульс-форез), клонирования ДНК в искусственных хромосомах дрожжей (YAC); реакции специфического расщепления ДНК, опосредованная RecA белком (РСР).
Применение YAC'ob как векторов позволяет клонировать последовательности ДНК генома эухариот величиной до 1000 т.п.н. Фрагменты такого размера необходимы для исследования структуры и функции районов
- локализации жизнзнно важных генов. С помощью YAC'ob удается изолировать также трудно клонируемые в бактериях фрагменты генома, обогащенные
повторами. Кроме того, так показал опыт работы по созданию физических карт хромосом человека в рамках программы "Геном человека", наличие YAC'ob значительно ускоряет и облегчает процесс построения таких карт, особенно на первом этапе сбора контигов. Поэтому метод YAC весьма перспективен для изоляции больших.непрерывных сегментов зукариотическогр генома. Последнее обстоятельство особенно важно при исследовании организации районов локализации повторяющихся элементов, в частности, в теломерах. При работе с. крупными геномами высших эукариат уке недостаточно тех возможностей, которые предоставляются набором обычных эндснуклеаз. требуется большая специфичность. Этого можно достичь с помощью комбинирования РСР и пульс-фореза.
Концы зукариотических хромосом - теломеры - выполняют особые функции, необходимые дгл^ поддержания структурной целостности хромосом и полной репликации их генетического материала. Теломеры представлены повторяющимися последовательностями различного типа. К простым концевым
повторам хроиосом человека (TTAGGG)n примыкают протяженные
субтеломерные повторы [Blackburn & Szcostak. 1984]. которые могут быть
отнесены к классу среднеповторяющихся последовательностей. Функция
большинства из них неизвестна. Такие ассоциированные с теломерами
последовательности выявлены у многих эукариотических организмов: у дрожжей,
ржи, хирономуса, аскариды, мыши и человека [Chan & Туе, 1983; Bsdbruk el al.,
1980; Saiga & Edstram, 1985; Cook etal.,'1985]. '"4
Структура субтеломерных областей хромосом человека слабо изучена, в основном, из-за отсутствия в современных геномных библиотеках физических концов хромосом.
Цель и задачи нзстсящей работы. В лаборатории проф. Ритмана (США) была сконструирована геномная библиотека хромосом чзлозека в составе полу-YAC'ob, обогащенная последовательностями ДНК человека с (TTAGGG}n повторами [Riethman et al., 1983], характерными для теломер человека. Псяу-УАС'и представляет искусственную хромосому дрожжей, у которой отсутствует теломерная последовательность на одном из концов. В. процессе анализа отдельных клонов данной- библиотеки оказалось, что часть из них содержит фрагменты из внутренних областей хромосом с (TTAGGG)n повторами. В связи с зтйм целью- диссертационной работы было подтвердить происхождение клонированной ДНК из теломерной области. Для этого следовало решить следующие задачи;
подтвердить происхождение ДНК данных попу-УАС'ов из области хромосомы, соответствующей ее физическому концу,
устанозить вдентичность структуры фрагментов, клонированных в полу-YAC'ax, структуре субтеломерной области хромосом человека,
построить физические карты клонированных фрааїєнтоз,
- изучить строение дакных фрагментов на уровне нуклеотидной последовательности,
- осуществить поиск полиморфизма теломер человека.
Нзг'чная ноеязяа и практическая ценность работы.
В результате проделанной работы были получены дрожжевые трансформанты, содержащие полу-УАС'и с клонированными е них фрагментами
г t
ДНК генома человека из сегмента 1q44. Показано, что они содержат ДНК, являющуюся физическим концо'м длинного плеча хромосомы 1.
Построена физическая карта фрагмента ДНК прителомерной области
длинного плеча хромосомы 1 человека протяженностью 260 т.п.н. по сайтам
редкощепящих рестриктаз. <
. В составе плазмидного вектора клонирован фрагмент ДНК, включающий СрСЗчхлровоіс. расположенный на .растоянии 50 т.п.н. от физического конца большого плеча хромосомы 1. Определена нуклеотидная последовательность 6 участгаз, расположенных на различном удалении от фиэичесазго конца длинного плеча хромосомы 1, общей протяженностью 14 т.п.н.
Достоверная физическая карта субтеломерного района протяженностью 60 т.п.н., построенная по сайтам среднещепящих рестриктаз; а также вновь полученные уникальные и низкокопийные зонды могут быть использованы для выявлении тонких структурных изменений субтеломерной области длиного плеча хромосомы 1 человека при исследовании различных генетических аномалий, связанных с субтеломерной областью хромосом человека, которые не могут быть обнаружены цитогенетическими методами.
Методом флуоресцентной in situ гибридизации показано предпочтительное распределение низкокопийных проб рНС1403 (размером 1,2 т.п.н.) и рНС1405 (размером 3,0 т.п.н.) в субтеломерных областях хромосом, причем для каждой пробы характерен свой набор теломер, где она может быть лсяализована. '
Дополнительно получены дрожжевые трансформанты, содержащие полу-УАС'и с фрагментами ДНК, принадлежащими хромосомам 2, 8.8, 12, 13, 14 и 18. Исследован полиморфизм теломер 1q, 2q, 6q, 8р, 8q, 12q, 13q, 14q, 18p и 18q гехэмз человека методом специфического расщепления ДНХ, опосредованного RecA белком. Показано, что в выборке из 11 неродственных индивидуумов, на уровне разрешения данного метода, у 1q, 8q, 12q, 13q, 18p и 18q полиморфизма нет, ay 2q, 6q, p и 14q плеч хромосом он наблюдается и составляет от 100 т.п.н. до 300 т.п.н.
Апробацяя работ ы. Результаты работы были представлены на конференциях в Сой Spring Harbor Laboratory по геному челсзека в 1S93 и 1994 годах к семинарах лаборатории молекулярной генетики дрожжей ИМГ РАН.
ї 1
Публикации. По материалам диссертации опубликовано и находиться в печати 4 статьи и 3 тезисных сообщения.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и обсуждение, выводы и список литературы. Работа изложена на ... страницах машинописного текста, включая ... рисунков, ... таблиц, и список литературц содержащий ... ссылок.