Введение к работе
Актуальность задачи.
Сенсорные нейроны, и, в частности, нейроны в составе дорзального корневого ганглия позвоночных," часто рассматриваются как удобные модели для изучения различных свойств нейронов. Вниманиие исследователей было сфокусировано на изучении структуры рецепторов сенсорных нейронов и их функций, механизмов трансдукции сигнала внутри клеток и способов передачи информации от сенсорных леяронов к центральной нервной системе; в то же время все чаше игнорировались индивидуальные характеристики сенсорных нейронов.
Индивидуальность клетки определяется, прежде всего,
дифференциальной экспрессией генов. . Более того,
ткане-специфическая экспрессия генов определяет будущее клетки и играет критическую роль в функционировании определенного типа' клеток «Wegner et. al.,1993l. На сегоднешний день проведен ряд исследований, показывающих количественное различие в содержаннии структурно-функциональных элементов нейронов: мембранных рецепторов и ионных каналов, нейропептидов, транскрипционных факторов, неирофиламентов и т.д. (Schmidt R.F.,1976). Однако, в последнее время стали появляться работы, где найдены гены, специфически транскрибируювдеся в сенсорных нейронах ПНС и не транскрибирующиеся в нейронах ЦНС (Ninklna et. al.,1993).
Одним из классических объектов для изучения сенсорных нейронов и глиальных клеток является дорзальний корневой ганглий (ДКГ), потому что: 1) ДКГ содержит всего три основных типа клеток - Шйамовтки [«тетки Сглмалътго клетки*, А-вФлакиа СЛ«-, А0- » А5-волокна) и С-волокна (сенсорные нейроны); 2) сенсорные нейроны ЛКГ отвечает за передачу информации Іболь, чувство температуры, осязание и т. я.) от всех частей тела, кроме головы, в головной мозг через спинной мозг (Koerber et. al.,1988).
Клетки ДКГ отличаются от. сенсорных нейронов и глиальных клеток центральной нервной системы и между собой по биохимическому составу, свойствам цитоплаэматическоя мембраны, зависимости от неяротрофинов и истории развития в эмбриогенезе (Perl E.R.,1992), что определяет роль клеток в сенсорных Функциях
(Ransom et. al.,1977; Dlchter et. al.,1977: Matsuda et. al.,1078).Кроне того, в группах А- и С-волокои, в свою очередь, есть вариабельность: по количеству шипиков на сенсорной нейроне, по связи с различными нейронами спинного мозга, по типу передаваемой информации и т. д. (Marper et. al.,1985: Rltter et. al..19681.
В связи с вышеизложенным, клонирование генов, экспрессируюшихся в клетках дорзального корневого ганглия и не экспрессируюшихся в других нейронах и глиалышх клетках, представляет собой актуальную задачу.
Цель работы.
Основная цель настоящей работы состояла в клонировании генов, специфически экспрессирусшихся в дорзальнои корневой ганглии, и модификации для этой цели метода конструирования субтрактивной кДНК библиотеки и ее дифференциального скрининга.
Исходя из поставленной цели были сформулированы следуюшиа задачи:
1. Модификация на более простых системах метода
конструирования субтрактивноя кДНК библиотеки из малых количеств
поли(А)+РНК.
2. ' Модификация на более простых системах метода
дифференциального- скрининга субтрактивной кДНК библиотеки, для
достижения его высокой чувствительности и исключения артефактов
клонирования на этапе скрининга.
-
Применение модифицированного метода конструирования субтрактивной кДНК библиотеки и дифференциального скрининга для клонирования -генов, специфически экспрессирусшихся в дорзальнои корневом ганглии новорожденных крыс.
-
Применение, на примере клонирования капсаицинового рецептора, субтрактивной кДНК библиотеки для клонирования генов согласно свойству их продуктов трансляции (функциональное клонирование).
Научная новизна и практическое значение работы. В настоящей работе был модифицирован метод конструирования . субтрахтивных кДЖ библиотек, позволяющий обходиться иалъы количество» ткани (100-10000 клеток). Примененыя метод
дифференциального скрининга позволил повысить чувствительность клонирования и исключить артефакты клонирования. При усовершенствовании на простых системах метода, конструирования субтрактивноя кДНХ библиотеки и ее дифференциального скрининга были выделены новые гены MB, MF, ЗЕ7 и ЗС6, изменяющие транскрипционную активность при постнатальном развитии крыс, новыя ген МК, экспрессирующияся в коре головного мозга и не экспрессирующияся в мозжечке взрослых крыс и новыя ген 3L4, преимущественно экспрессируюшияся в мозжечке взрослых крыс.
Впервые было проклонировано 19 генов, экспрессируюшихся в клетках дорзального корневого ганглия и не регистрирующихся Нозерн гибридизацией в клетках головного мозга , печени и почек новорожденных крыс. Из них 6 генов. (В1, В2, В4, Н7, 14 и G7) строго специфично -транскрибируются в клетках дорзального корневого ганглия.
Субтрактивная кДНК библиотека из дорзального корневого ганглия была применена для функционального клонирования капсаицинового рецептора.
Практическое значение настоящей работы состоит в возможности создания в будущем, на основе функциональных свояств ДКГ специфических белков, более эффективных антиболевых средств направленного действия и объяснения механизмов трансдукции болевых ощущений, терморецепции и осязания.
Апробация работы.
Материалы работы представлены на IY Всесоюзной школе-семинаре молодых ученных "Перспективные направления и новые методы в молекулярной биологии" (г. Рига, 1990г.) и 15th annual Meeting of the Europian Neurosclence Association. Munich 13-17 September 1992.
Публикации.,
По материалам диссертации опубликовано и находится в печати 3 работы.
Объем и структура диссертации.
Работа иэложэна на 132 страницах машинописного текста. Она
включает: введение, обэор литературы, экспериментальную часть, обсуждение результатов, выводы и список цитируемой литературы (всего 162 названий). Диссертация содержит 16 рисунков и 2 таблицы.