Введение к работе
Актуальность проблемы. Важнейшие метаболиты ароматической природы: витамины Е и К, фолиевая кислота, сидерофоры, некоторые антибиотики, ароматические аминокислоты (фенилаланин, тирозин, триптофан) образуются в ходе реакций шикиматного биосинтетического пути. Часть этих соединений не синтезируется в клетках животных и относится к незаменимым факторам питания. Особый практический интерес представляет синтез микроорганизмами ароматических аминокислот, необходимых для нужд медицины и пищевой промышленности.
Применение генно-инженерных подходов" способствует решению практических задач по снятию негативного контроля, препятствующего сверхсинтезу, по обнаружению и устранению "узких мест" в пути биосинтеза ароматических аминокислот.
Характерной особенностью шикиматного пути в клетках В.subtilis является объединение ферментов З-дезокси-Д-арабиногеп-тулозо-7-фосфат-синтазы (ДАГФ-синтазы), хоризмат мутазы и шикимат-киназы в трифункциональный комплекс. Этому комплексу принадлежит ключевая роль в системе аллостерического ингибирования, которая, в свою очередь, является основным механизмом в осуществлении негативного контроля за синтезом хоризмата, предшественника фенилала-нина, тирозина и триптофана
Дзе ферментативные активности комплекса (ДАГФ-синтазная и ши-кимат-киназная) ингибируются субстратом (хоризматом) и продуктом (префенатом) третьего фермента комплекса (хоризмат мутазы). Получить штаммы В.subtilis с десенсибилизированными формами первых двух ферментов до сих пор не удалось.
Таким образом, важная роль мультиферментного комплекса ДАГФ-синтаза - хоризмат мутаза - шикимат киназа в синтезе ароматических аминокислот у В.subtilis определила наш интерес к изучению особенностей его регуляции, а также к исследованию структуры генов, кодирующих ферменты комплекса.
Основные цели нашей работы заключались в клонировании генов В.subtilis, кодирующих ферменты трифункционального комплекса ДАГФ-синтаза- хоризмат мутаза - шикимат киназа, анализе структуры клонированных фрагментов, а также в получении мутантов с измененной регуляцией активностей ферментов комплекса.
Научная новизна и прикладная ценность работы. В клетках
В.subtilis впервые клонированы гены aroA-aroG (ДАГФ-синтаза - хоризмат мутаза) и ген arol (шикимат киназа) из В.subtilis 168. построены рестрикционные карты, проведен делеционный анализ клонированных фрагментов.
Получен и охарактеризован новый класс мутантов В. subtilis IBS с нарушениями в области агої гена, рост которых чувствителен к L-тирозину - tsg (L-tyrosine sensitive grovrth) мутанты. Показано, что рост на минимальной среде мутантного штамма В.subtilis tsg-36 чувствителен к очень низким (около 0,1 мкг/мл) концентрациям L-ти-розина и к повышенной С45-48'С) температуре (вне зависимости от присутствия тирозина).
Новая мутация tsg-36 картирована в области агої гена В. subtilis.
В опытах in vivo и in vitro показано, что у В. subtilis tsg-36 мутанта в присутствии L-тирозина инактивируется фермент общего пути синтеза фенилаланина и тирозина - хоризмат мутаза Тем самым продемонстрировано, что для получения функциональных изменений в одной полипептидной цепи мультиферментного комплекса (ДАГФ-синтаз-ной - хоризмат мутазной) можно использовать мутационные нарушения в гене, кодирующем другую его полипептидную цепь (шикимат киназ-ную).
Получен штамм В. subtilis tsg-36 amyE4 recE::cat, и в этот реципиент введены гибридные плазмиды, содержащие aroA-aroG ген и агої ген. Обнаружено, что как тирозин-чувствительность, так и тем-пературочувствительность роста исследуемого мутанта полностью ком-плементируются клонированным на плазмиде геном arol (шикимат кина-зы) и частично - клонированным геном aroA-aroG (ДАГФ-синтазы - хоризмат мутазы). Свойства новых tsg мутантов расширяют существующие представления о регуляции биосинтеза ароматических аминокислот в В. subtilis.
Клонированные гены aroA-aroG и агої введены в составе многокопийных плазмид в клетки селекционного штамма В. amyloliquefaciens А74. Показано, что введение гена aroA-aroG увеличивает продуцию фенилаланина.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введе-